elisa實驗ppt課件(已改無錯字)
2023-02-06 14:07:41 本頁面
【正文】 按加量及比色液的最終體積而異，在板式 ELISA中一般采用 2mol/L。 4 對照設定 陽性對照品 (positive control)和陰性對照品 (negative control)是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結果的對照。 陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致，多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質。 加入的量應與試劑的敏感度相稱； 在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較，可以估計標本物質的量。 參考標準品 定量測定（如甲胎蛋白質，癌胚抗原測定等）應含有制作標準曲線用的參考標準品，應包括覆蓋可檢測范圍的 45個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中 . 陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質。例如 HBsAg檢測的陰性對照品中不可含 HBsAg，最好抗 HBs也是陰性。 5 標本的采取和保存 體液、分泌物和排泄物等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份。 以血清標本為例：血漿中除尚含有 纖維蛋白原 和 抗凝劑 外，其他成份同血清。血漿和血清可同等應用。 血清標本應避免溶血：紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質，以 HRP為標記的 ELISA測定中，可能會增加非特異性顯色。 加樣 : 在 ELISA中一般有 3次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物。加樣時應將所加物加在 LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。 基本操作注意事項 保溫 抗原抗體完成反應的保溫過程稱為溫育 (incubation)。 ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發(fā)生。為什么 ELISA反應總是需要一定時間的溫育？ 溫育常采用的溫度有 43℃ 、 37℃ 、室溫和 4℃ （冰箱溫度）等。 37℃ 是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結合的合適溫度。 保溫方式： ELISA儀器附有特制的電熱塊，水浴。 若用保溫箱： ELISA板放在濕盒內，在盒底墊濕的紗布，最后將 ELISA板放在濕紗布上。反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。 室溫溫育的反應，操作時的室溫應嚴格限制在規(guī)定的范圍內，標準室溫溫度是指 2025℃ ，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育。應注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定力求準確。為保證這一點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。 洗滌 洗滌在 ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成敗。 ELSIA洗滌：達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。 清除殘留在板孔中游離的物質，以及非特異性地吸附的干擾物質。 聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。 可以說在 ELISA操作中，洗滌是最主要的關鍵技術。 洗滌的方式除某些 ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作有 流水沖洗式和 浸泡式兩種： （ 1）流水沖洗式 流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液為蒸餾水，自來水。洗滌效果更為徹底，且也簡便、快速。已有實驗表明，流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。 （ 2）浸泡式 微量滴定板多采用。洗滌液為 非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是 疏水性 的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，使蛋白質回復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。 顯色 顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。 TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀察結果。但為保證實驗結果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當時間閱讀結果。 TMB經(jīng) HRP作用后，約 40分鐘顯色達頂峰，隨即逐漸
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