elisa實驗ppt課件-在線瀏覽
2025-02-23 14:07本頁面
【正文】 接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體 建立檢測相應(yīng)抗體的方法。 競爭法測抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的 位點，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，可以采用競爭法模式。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。 捕獲包被法測抗體 IgM的檢測常用于傳染病的診斷。 此法常用于病毒性感染的早期診斷。 （ 1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）； （ 2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）； （ 3）酶的底物； （ 4）陰性對照品和陽性對照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品； （ 5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液； （ 6）洗滌液； （ 7）酶反應(yīng)終止液 ELISA的試劑準(zhǔn)備 A 固相載體 聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。 包被的方式 將抗原或抗體固定在固相載體的過程稱為包被 (coating)。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響。 不易吸附 的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法。 脂類物質(zhì) 無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入 ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面?？乖昧可伲瑑H為直接包被的 1/10乃至于 /100。 合成多肽抗原 是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。 取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液 .須除去雜抗體后才能用于 ELISA，以保證試驗的特異性。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。 加入包被液后，在 48℃ 冰箱中放置過夜， 37℃ 中保溫 2小時。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為 10ng/ml20ug/ml。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥 ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。 10%的小牛血清或 1%明膠。 所有的 ELISA固相均需封閉？ 洗滌液 在板式 ELISA中，常用的稀釋液為含 %吐溫 20磷酸鹽緩沖液。 結(jié)合物用的抗原和抗體 制備結(jié)合物時所用純度較高的 IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時其他雜蛋白的干擾。在 ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。 酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。 HRP是一種糖蛋白，含糖量約為 18%，分子量為 44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。 （ 1） 戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團試劑，可使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結(jié)。 交聯(lián)反應(yīng)是隨機的，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。過碘酸鈉將 HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成 chiff氏堿而結(jié)合。但游離的抗體則會與酶標(biāo)抗體競爭相應(yīng)的固相抗原，因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測，效果更好。 結(jié)合物的保存 酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護(hù)劑。 結(jié)合物的稀釋液 用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時不需再行稀釋，在 48℃ 保存期可達(dá) 6個月。 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中， DH2為供氧體， H2O2為受氫體。 DH2如：鄰苯二胺 (OPD)、 四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)和 ABTS 。 TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1