轉(zhuǎn)染技術(shù)原理及應(yīng)用-資料下載頁(yè)
2025-07-14 22:42本頁(yè)面
【正文】 率。因此在轉(zhuǎn)染前建議先測(cè)(轉(zhuǎn)右)試出對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)良好的血清批號(hào)，轉(zhuǎn)染時(shí)用同一批號(hào)的血清，并同時(shí)做負(fù)對(duì)照（不加轉(zhuǎn)染試劑及外源DNA）以測(cè)試細(xì)胞生長(zhǎng)是否正常。有些轉(zhuǎn)染技術(shù)如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染在有血清存在情況下效率很低，因此在轉(zhuǎn)染前要除血清。但有些對(duì)此敏感的細(xì)胞如原代細(xì)胞會(huì)受到損傷，甚至死亡導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率極低。3. 載體構(gòu)建轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建（病毒載體，質(zhì)粒DNA，RNA，PCR產(chǎn)物，寡核苷酸等）也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。病毒載體對(duì)特定宿主細(xì)胞感染效率較高，但不同病毒載體有其特定的宿主，有的還要求特定的細(xì)胞周期，如逆轉(zhuǎn)錄病毒需侵染分裂期的宿主細(xì)胞，此外還需考慮一些安全問題（如基因污染）。除載體構(gòu)建外，載體的形態(tài)及大小對(duì)轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響，如前面提到的超螺旋及線性DNA對(duì)瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的影響。如果基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒性作用，轉(zhuǎn)染也很難進(jìn)行，因此選擇組成或可調(diào)控，強(qiáng)度合適的啟動(dòng)子也很重要，同時(shí)做空載體及其它基因的相同載體構(gòu)建的轉(zhuǎn)染正對(duì)照可排除毒性影響的干擾。4. DNA質(zhì)量DNA質(zhì)量對(duì)轉(zhuǎn)染效率影響非常大。一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)（如脂質(zhì)體等）基于電荷吸引原理，如果DNA不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進(jìn)行。核酸純化世界第一品牌德國(guó)QIAGEN公司提供的超純質(zhì)粒抽提試劑盒，能達(dá)到兩倍2x CsCl梯度離心以上的純度效果，使您不必為DNA質(zhì)量操心。此外，對(duì)一些內(nèi)毒素敏感的細(xì)胞（如原代細(xì)胞，懸浮細(xì)胞和造血細(xì)胞），QIAGEN還提供可去除內(nèi)毒素污染的質(zhì)粒抽提試劑盒，在質(zhì)粒抽提過(guò)程中有效去除脂多糖分子，保證理想的轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大，許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例，細(xì)胞數(shù)量，培養(yǎng)及檢測(cè)時(shí)間等。一些傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，如DEAE右旋糖苷法，磷酸鈣法，電穿孔法，脂質(zhì)體法各有利弊，其主要原理及應(yīng)用特點(diǎn)見下：轉(zhuǎn)染方法 原理 應(yīng)用 特點(diǎn) DEAE右旋糖苷法帶正電的DEAE右旋糖苷與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 相對(duì)簡(jiǎn)便、結(jié)果可重復(fù)但對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用，轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清磷酸鈣法磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 不適用于原代細(xì)胞，操作簡(jiǎn)便但重復(fù)性差，有些細(xì)胞不適用。電穿孔法高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，DNA通過(guò)膜上形成的小孔導(dǎo)入 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染，所有細(xì)胞 適用性廣但細(xì)胞致死率高，DNA和細(xì)胞用量大，需根據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)化電穿孔實(shí)驗(yàn)條件 陽(yáng)離子性的脂質(zhì)體法帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染，所有細(xì)胞 適用性廣，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好但轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大 病毒介導(dǎo)法逆轉(zhuǎn)錄病毒 通過(guò)侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，特定宿主細(xì)胞 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞，體內(nèi)細(xì)胞等，但攜帶基因不能太大細(xì)胞需處分裂期，需考慮安全因素 ，腺病毒 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，特定宿主細(xì)胞 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，需考慮安全因素。 Biolistic 顆粒傳遞法將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細(xì)胞，DNA在胞內(nèi)逐步釋放，表達(dá)瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 可用于：人的表皮細(xì)胞，纖維原細(xì)胞，淋巴細(xì)胞系以及原代細(xì)胞 顯微注射法用顯微操作將DNA直接注入靶細(xì)胞核 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限，多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的胚胎細(xì)胞第 7 頁(yè) 共 7 頁(yè)
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