轉染技術原理及應用-展示頁
2024-07-29 22:42本頁面
【正文】 效率和低的細胞毒性，其可降解性對體內應用也具有重要的意義。超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基，在染實驗中發(fā)現(xiàn)這種PEI的毒性低，但轉染效率卻較高。線型PEI（Line PEI,LPEI）與其衍生物用作基因轉染載體的研究比分枝狀PEI（Branched PEI,BPEI）要早一些，過去的研究認為在不考慮具體條件，LPEI/DNA轉染復合物的細胞毒性較低，有利于細胞定位，因此與BPEI相比應該轉染效率高一些。大量實驗證明，PEI是非常有希望的基因治療載體。聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽離子電荷密度的有機大分子，每相隔二個碳個原子，即每“第三個原子都是質子化的氨基氮原子，使得聚合物網(wǎng)絡在任何pH下都能充當有效的“質子海綿”(proton sponge)體。除上述傳統(tǒng)方法外，近年來國際上推出了一些陽離子聚合物基因轉染技術，以其適用宿主范圍廣，操作簡便，對細胞毒性小，轉染效率高受到研究者們的青睞。轉染效果隨細胞類型變化大Biolistic顆粒傳遞法將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細胞，DNA在胞內逐步釋放，表達瞬時性轉染可用于：人的表皮細胞，纖維原細胞，淋巴細胞系以及原代細胞顯微注射法用顯微操作將DNA直接注入靶細胞核穩(wěn)定轉染瞬時性轉染轉染細胞數(shù)有限,多用于工程改造或轉基因動物的胚胎細胞（各種轉染方法的比較）轉染技術的選擇對轉染結果影響也很大，許多轉染方法需要優(yōu)化DNA與轉染試劑比例，細胞數(shù)量，培養(yǎng)及檢測時間等。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉入量低但整合率高。一般來說，超螺旋質粒DNA轉染效率較高，在轉染后2472小時內（依賴于各種不同的構建）分析結果，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測。細胞轉染技術原理及應用常規(guī)轉染技術分為兩大類，一類是瞬時轉染，一類是穩(wěn)定轉染（永久轉染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數(shù)，產生高水平的表達，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動子和其它調控元件的分析。后者也稱穩(wěn)定轉染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉染細胞能整合，通常需要通過一些選擇性標記，如來氨丙基轉移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復篩選，得到穩(wěn)定轉染的同源細胞系。一些傳統(tǒng)的轉染技術，如DEAE右旋糖苷法，磷酸鈣法，電穿孔法，脂質體法各有利弊，其主要原理及應用特點見下表：轉染方法原理應用特點磷酸鈣法磷酸鈣DNA復合物吸附細胞膜被細胞內吞穩(wěn)定轉染瞬時性轉染不適用于原代細胞操作簡便但重復性差有些細胞不適用DEAE右旋糖苷法帶正電的DEAE右旋糖苷與核酸帶負電的磷酸骨架相互作用形成的復合物被細胞內吞瞬時性轉染相對簡便、結果可重復但對細胞有一定的毒副作用轉染時需除血清電穿孔法高脈沖電壓破壞細胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導入穩(wěn)定轉染瞬時性轉染所有細胞適用性廣但細胞致死率高，DNA和細胞用量大， 需根據(jù)不同細胞類型優(yōu)化電穿孔實驗條件病毒介導法通過侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中穩(wěn)定轉染可用于難轉染的細胞、原代細胞，體內細胞等逆轉錄病毒特定宿主細胞但攜帶基因不能太
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