【正文】 胺凝膠采用垂直裝置進(jìn)行電泳。? 凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。例如，20%的聚丙烯酰胺凝膠可分離16bp的DNA小片段，而若要分離1000bp的DNA片段，就要用3%的聚丙烯酰胺凝膠。再如，2%的瓊脂糖凝膠可分離300bp的雙鏈DNA分子，而分離大片段DNA就要用低濃度(%～%)的瓊脂糖凝膠。? 瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。將瓊脂糖粉末加熱到熔點(diǎn)后冷卻凝固便會(huì)形成良好的電泳介質(zhì)。經(jīng)過化學(xué)修飾的低熔點(diǎn)瓊脂糖，在較低的溫度下便會(huì)熔化，常用于DNA片段的制備電泳。瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì),其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場(chǎng)中,在中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定：? （1）DNA的分子大小：線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。? （2）瓊脂糖濃度。一個(gè)給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。%,%, %。 ? （3）DNA分子的構(gòu)象。當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí),它在電場(chǎng)中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的，超螺旋DNA移動(dòng)最快，而線狀雙鏈DNA移動(dòng)最慢。? （4）電源電壓。在低電壓時(shí),線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達(dá)到最大，所加電壓不得超過5v/cm。? （5）嵌入染料的存在。熒光染料溴化乙啶用于檢測(cè)瓊脂糖凝膠中的DNA，染料會(huì)嵌入到堆積的堿基對(duì)之間并拉長(zhǎng)線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強(qiáng)，還會(huì)使線狀DNA遷移率降低15％。? （6）離子強(qiáng)度影響。電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(shí)(如誤用蒸餾水配制凝膠)，電導(dǎo)率最小,DNA幾乎不移動(dòng)，在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加10電泳緩沖液),則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。 第五節(jié) DNA克隆技術(shù)? DNA克隆技術(shù)又稱基因克隆技術(shù)是分子生物學(xué)的核心技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)的主要目的是獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝。有了這些與親本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的結(jié)構(gòu)與功能，并可達(dá)到人為改造細(xì)胞以及物種個(gè)體的遺傳性狀的目的。? DNA克隆的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)是重組DNA技術(shù)，重組DNA是用酶學(xué)的方法，將不同來源的DNA分子在體外進(jìn)行特異切割，重新連接，組裝成一個(gè)新的雜合DNA分子。在此基礎(chǔ)上，這個(gè)雜合分子能夠在一定的宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，形成大量的子代分子，此過程稱為基因克隆。有目的地通過基因克隆技術(shù)，人為操作改造基因，改變生物遺傳性狀的系列過程，總稱為基因工程。重組DNA技術(shù)的基本原理重組DNA(rebinant DNA) 分子克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子——復(fù)制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或 DNA克隆) 。 基本原理（圖解）基本原理（圖解）目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá) （一）目的基因的制備1. 化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列 。(genomic DNA library)3. cDNA文庫(kù)(cDNA library)4. 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)* 化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫(kù)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合* 從基因組DNA文庫(kù)獲取目的基因mRNA cDNA 雙鏈cDNA 重組DNA分子 cDNA文庫(kù) 反轉(zhuǎn)錄酶 載體 受體菌 復(fù)制* 從cDNA文庫(kù)獲取目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶A A A A T T T T AAAASI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ堿水解 T T T T（二）目的基因與載體的連接1. 粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接2. 同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。3. 平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶15186。C重組體載體自連目的基因 自連4. 人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。 （三）重組DNA導(dǎo)入受體菌受體菌條件安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(petent) 導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化 (transformation)轉(zhuǎn)染 (transfection)感染 (infection)（四）重組體的篩選和鑒定 1. 直接選擇法(1) 抗藥性標(biāo)記選擇（遺傳學(xué)方法）(2) 標(biāo)志補(bǔ)救(marker rescue)(3) 分子雜交法原位雜交Southern印跡 2. 免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等小 結(jié)重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為 分分離目的基因 切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌 篩篩選重組體 克隆基因的表達(dá)表達(dá)體系的建立表達(dá)載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的建立表達(dá)產(chǎn)物的分離純化1. 原核表達(dá)體系 （）標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志 強(qiáng)啟動(dòng)子 翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點(diǎn) 不宜表達(dá)真核基因組DNA不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體 (inclusion body) 很難表達(dá)大量可溶性蛋白2. 真核表達(dá)體系 酵母、昆蟲、乳類動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組DNA可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)染 —— 將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 顯微注射 第五節(jié) 免疫學(xué)檢測(cè)原理? 免疫學(xué)檢測(cè)乃借助免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)理論或技術(shù)，對(duì)抗原、抗體、免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子等進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)在醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，并在臨床實(shí)踐中用于探討免疫相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制及其診斷、病情監(jiān)測(cè)與療效評(píng)價(jià)等。隨著現(xiàn)代免疫學(xué)以及細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的進(jìn)展，免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)不斷發(fā)展和更新。第一節(jié) 抗原抗體反應(yīng)的原理 抗原抗體反應(yīng):指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。 物質(zhì)基礎(chǔ): 抗原表位與抗體高變區(qū)間的互補(bǔ)結(jié)合 抗原表位與抗體高變區(qū)的溝槽分子表面的結(jié)合 抗原抗體之間的結(jié)合力 親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體一、抗原抗體結(jié)合力靜電引力（electrostatic forces）范德華引力:作用最?。╲an der Waals interactions）氫鍵:最具特異性（hydrogen bond ）疏水作用力:作用最大 （hydrophobic interactions） 二、抗原抗體的親和力和親合力親和力(affinity)?？贵w分子上一個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的抗原決定簇之間相適應(yīng)而存在著的引力，是抗原抗體間固有的結(jié)合力親合力(avidity):抗體結(jié)合部位與抗原表位之間結(jié)合的強(qiáng)度三、親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體可見反應(yīng)抗原抗體復(fù)合物 (疏水膠體)電解質(zhì) 抗原(親水膠體) 抗體(親水膠體)第二節(jié) 抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)特異性 可逆性 比例性 階段性一、特異性特異性：抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的專一性分子基礎(chǔ):抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補(bǔ)性交叉反應(yīng)（cross reactions）兩種不同的抗原分子具有部分相同或類似結(jié)構(gòu)的抗原表位，可與彼此相應(yīng)的抗血清發(fā)生反應(yīng)二、可逆性可逆性：抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體的特性 影響因素：抗體對(duì)相應(yīng)抗原的親合力－親合力越高，結(jié)合越牢固，越不易解離 環(huán)境因素對(duì)復(fù)合物的影響－pH、離子強(qiáng)度 三、比例性比例性：抗原與抗體發(fā)生可見反應(yīng)需遵循一定的量比關(guān)系前帶(prezone)：抗體過量后帶(postzone)：抗原過量等價(jià)帶(equivalence zone)：抗原抗體比例合適 四、階段性第一階段：特異性結(jié)合階段，反應(yīng)快，不可見 第二階段：反應(yīng)可見階段，反應(yīng)慢，出現(xiàn)凝集、 沉淀和細(xì)胞溶解等現(xiàn)象 第三節(jié) 影響抗原抗體反應(yīng)的因素一、反應(yīng)物自身因素抗原:理化性狀、表位種類和數(shù)目抗體:來源、特異性、親和性、效價(jià)二、環(huán)境因素電解質(zhì): 生理鹽水或緩沖液 酸堿度: pH6～pH9 溫 度: 15℃～40℃，37℃最適第四節(jié) 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的類型反應(yīng)類型實(shí)驗(yàn)技術(shù)結(jié)果判斷凝集反應(yīng)直接凝集試驗(yàn)觀察凝集現(xiàn)象間接凝集試驗(yàn)同上抗球蛋白試驗(yàn)同上沉淀反應(yīng)液相沉淀試驗(yàn)觀察沉淀，檢測(cè)濁度免疫電泳技術(shù)觀察掃描沉淀峰、沉淀弧補(bǔ)體參與的反應(yīng)補(bǔ)體溶血試驗(yàn)觀察測(cè)定溶血現(xiàn)象補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)同上反應(yīng)類型實(shí)驗(yàn)技術(shù)結(jié)果判斷中和反應(yīng)病毒中和試驗(yàn)檢測(cè)病毒感染性毒素中和試驗(yàn)檢測(cè)外毒素毒性標(biāo)記免疫反應(yīng)熒光免疫技術(shù)檢測(cè)熒光現(xiàn)象放射免疫技術(shù)檢測(cè)放射性強(qiáng)度酶免疫技術(shù)檢測(cè)酶底物顯色發(fā)光免疫技術(shù)檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度金免疫技術(shù)檢測(cè)金顆粒沉淀標(biāo)記免疫技術(shù)：用熒光物質(zhì)、放射性核素、酶或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等標(biāo)記抗原或抗體，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)后，通過檢測(cè)標(biāo)記物對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定性、定位或定量分析按實(shí)際用途分為:①免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry technique,IHCT)②免疫測(cè)定(immunoassay)按測(cè)定反應(yīng)體系的物理狀態(tài)分為: ①均相免疫測(cè)定(homogenous immunoassay）②非均相免疫測(cè)定(heterogenous immunoassay) 按檢測(cè)現(xiàn)象分為: 射免疫技術(shù) ②熒光免疫技術(shù) ③酶免疫技術(shù) ④化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù) ⑤金免疫技術(shù)三、抗原抗體反應(yīng)的基本檢測(cè)方法? （一）凝集反應(yīng)（圖211）（掌握）? 細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在一定條件下出現(xiàn)肉眼可見的凝集物，此為凝集反應(yīng)(agglutination)。? 1．直接凝集 ? 2．間接凝集 ? 3．間接凝集抑制試驗(yàn) ? 各種凝集反應(yīng)示意圖? （二）沉淀反應(yīng)（掌握）? 可溶性抗原（血清蛋白質(zhì)、細(xì)胞裂解液或組織浸液、各種微生物蛋白分子等）與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在一定條件下出現(xiàn)肉眼可見的沉淀，此為沉淀反應(yīng)(precipitation)。? 1．單向免疫擴(kuò)散(single immunodiffusion) ? 2．雙向免疫擴(kuò)散(double immunodiffusion) ? 3．免疫電泳(immunoelectrophoresis)? 4．免疫比濁(immunonephelometry)單向免疫擴(kuò)散(single immunodiffusion)雙向免疫擴(kuò)散(double immunodiffusion) 免疫電泳(immunoelectrophoresis)對(duì)流免疫電泳火箭免疫電泳? （四）免疫標(biāo)記技術(shù)（熟悉） 免疫標(biāo)記技術(shù)（immunolabelling technique）乃用熒光素、酶、放射性核素或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等標(biāo)記抗體或抗原，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的檢測(cè)，是目前應(yīng)用最為廣泛的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。標(biāo)記物與抗體或抗原連接后并不改變抗原抗體的免疫特性，具有靈敏度高、快速、可定性、定量、定位等優(yōu)點(diǎn)。? 。? （四）免疫標(biāo)記技術(shù)? 1．免疫熒光法(immunofluorescence，IF) 此法乃用熒光素與抗體連接成熒光抗體，再與待檢標(biāo)本中抗原反應(yīng)，置熒光顯微鏡下觀察，抗原抗體復(fù)合物散發(fā)熒光，借此對(duì)抗原進(jìn)行定性或定位。? （1）直接熒光法：? （2）間接熒光法：免疫熒光法(immunofluorescence，IF)（四）免疫標(biāo)記技術(shù)immunoassay， EIA)1）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)：是酶免疫測(cè)定中應(yīng)用最廣的技術(shù)，用于測(cè)定可溶性抗原或抗體。其基本方法是：將已知抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，借助洗滌將固相上的抗原