【正文】 分辨率低，僅能達到1~3Mb，可檢測到的DNA序列間長度一般要求超過1Mb。? 常用的粘附劑有鉻礬明膠液、多聚賴氨酸溶液 、Vectorband Reagent粘附劑 、Tricholosilane（分子式為SiCl3(CH2)6CH=CH2 ） 、3氨丙基三乙氧基硅烷 （3Aminopropyl triethoxysilane, APES ）探針制備技術(shù) ? 探針的制備主要采用缺刻平移法、隨機引物法或者PCR擴增合成，對同位素標(biāo)記探針的方法還經(jīng)常用到末端標(biāo)記法。故一般用體外標(biāo)記法。常用的有切口平移法、隨機引物法、未端標(biāo)記法。 該方法使用時應(yīng)注意：，使用探針時要預(yù)先變性后再使用，而且標(biāo)記時DNA片段不太?。籅. DNA酶I使用的量要合適，太多會將DNA模板切碎，不能進行標(biāo)記反應(yīng)；太少則不能有效地打開缺口，使標(biāo)記物不能進入缺口；C. 標(biāo)記時間不能太短，太短時間會造成標(biāo)記量不足，影響雜交的進行。除此之外，該方法有如下一些優(yōu)點：；，可通過延長反應(yīng)時間來增加探針產(chǎn)量；，易于雜交的檢測； ，易于回收探針。 生物素光照法 光敏生物素在紫外線照射下與DNA或RNA的堿基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，與核酸形成牢固的共價結(jié)構(gòu)，再借助于酶的顯色反應(yīng)，即可顯示雜交的位置。 細(xì)胞分裂相應(yīng)盡可能干凈，沒有細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)的干擾。 用蛋白酶K酶解以增大材料的滲透性并除去與DNA粘連且抑制探針雜交的蛋白 。216。216。在將探針DNA加到待檢測的制片上后需于8090℃ 下共變性10分鐘。一般用2SSC洗3次,每次5～10min, 其中第1和第2次用42℃,第3次用室溫洗。 ? （1） （一）DNA芯片技術(shù)的基本原理 DNA芯片技術(shù)的基本原理是分子識別，與Southern雜交和Northern雜交同出一理，即DNA的堿基互補配對和序列互補原理。2. 基因芯片技術(shù)的主要特點 技術(shù)操作簡單 自動化程高 序列數(shù)量大 檢測效率高 應(yīng)用范圍廣 成本相對低3 基因芯片的主要類型 鑒于信號的獲取與解讀具有通用性，所以此處不予特別介紹。該方法有兩類：光引導(dǎo)原位聚合技術(shù)與壓電打印原位聚合技術(shù)。因此，每次通過控制蔽光膜的圖案（透光與不透光）決定哪些區(qū)域應(yīng)被活化，以及所用單體的種類和反應(yīng)次序就可以實現(xiàn)在待定位點合成大量預(yù)定序列寡聚體的目的。如此類推，可以合成出長度為40到50個堿基的探針。 優(yōu)點：設(shè)備廉價，技術(shù)簡便，研制周期短，靈活性高 缺點：點陣密度低從支持物來分主要有：　　薄膜型　如聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等。　　 微板型　這種芯片實質(zhì)上是一種具有高密度、小容量測試孔的小型酶聯(lián)免疫檢測板（如PE公司等）。? 大部分限制性內(nèi)切酶不受RNA或單鏈DNA的影響。? 若需要不同的鹽濃度，則低鹽濃度的限制性內(nèi)切酶必須首先使用，隨后調(diào)節(jié)鹽濃度，再用高鹽濃度的限制性內(nèi)切酶水解。分子在電場作用下的遷移速度，與電場強度和電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與分子的摩擦系數(shù)成反比。由于糖磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色，在紫外光下至少可以檢出110ng的DNA條帶，從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。把EB直接加到凝膠介質(zhì)中，染料便會與DNA分子結(jié)合，卻不能與凝膠相結(jié)合。? 瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣，不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進行電泳。? 瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。在電場中,在中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定：? （1）DNA的分子大?。壕€狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的，超螺旋DNA移動最快，而線狀雙鏈DNA移動最慢。? （5）嵌入染料的存在。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠)，電導(dǎo)率最小,DNA幾乎不移動，在高離子強度的緩沖液中(如誤加10電泳緩沖液),則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時會引起凝膠熔化或DNA變性。在此基礎(chǔ)上，這個雜合分子能夠在一定的宿主細(xì)胞中進行擴增，形成大量的子代分子，此過程稱為基因克隆。(genomic DNA library)3. cDNA文庫(cDNA library)4. 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)* 化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合* 從基因組DNA文庫獲取目的基因mRNA cDNA 雙鏈cDNA 重組DNA分子 cDNA文庫 反轉(zhuǎn)錄酶 載體 受體菌 復(fù)制* 從cDNA文庫獲取目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶A A A A T T T T AAAASI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ堿水解 T T T T（二）目的基因與載體的連接1. 粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接2. 同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。免疫學(xué)檢測技術(shù)在醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，并在臨床實踐中用于探討免疫相關(guān)疾病的發(fā)病機制及其診斷、病情監(jiān)測與療效評價等?？贵w分子上一個抗原結(jié)合點與對應(yīng)的抗原決定簇之間相適應(yīng)而存在著的引力，是抗原抗體間固有的結(jié)合力親合力(avidity):抗體結(jié)合部位與抗原表位之間結(jié)合的強度三、親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體可見反應(yīng)抗原抗體復(fù)合物 (疏水膠體)電解質(zhì) 抗原(親水膠體) 抗體(親水膠體)第二節(jié) 抗原抗體反應(yīng)的特點特異性 可逆性 比例性 階段性一、特異性特異性：抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的專一性分子基礎(chǔ):抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補性交叉反應(yīng)（cross reactions）兩種不同的抗原分子具有部分相同或類似結(jié)構(gòu)的抗原表位，可與彼此相應(yīng)的抗血清發(fā)生反應(yīng)二、可逆性可逆性：抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體的特性 影響因素：抗體對相應(yīng)抗原的親合力－親合力越高，結(jié)合越牢固，越不易解離 環(huán)境因素對復(fù)合物的影響－pH、離子強度 三、比例性比例性：抗原與抗體發(fā)生可見反應(yīng)需遵循一定的量比關(guān)系前帶(prezone)：抗體過量后帶(postzone)：抗原過量等價帶(equivalence zone)：抗原抗體比例合適 四、階段性第一階段：特異性結(jié)合階段，反應(yīng)快，不可見 第二階段：反應(yīng)可見階段，反應(yīng)慢，出現(xiàn)凝集、 沉淀和細(xì)胞溶解等現(xiàn)象 第三節(jié) 影響抗原抗體反應(yīng)的因素一、反應(yīng)物自身因素抗原:理化性狀、表位種類和數(shù)目抗體:來源、特異性、親和性、效價二、環(huán)境因素電解質(zhì): 生理鹽水或緩沖液 酸堿度: pH6～pH9 溫 度: 15℃～40℃，37℃最適第四節(jié) 免疫學(xué)檢測技術(shù)的類型反應(yīng)類型實驗技術(shù)結(jié)果判斷凝集反應(yīng)直接凝集試驗觀察凝集現(xiàn)象補體結(jié)合試驗同上反應(yīng)類型實驗技術(shù)結(jié)果判斷中和反應(yīng)病毒中和試驗檢測病毒感染性發(fā)光免疫技術(shù)檢測發(fā)光強度標(biāo)記物與抗體或抗原連接后并不改變抗原抗體的免疫特性，具有靈敏度高、快速、可定性、定量、定位等優(yōu)點。其基本方法是：將已知抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行，借助洗滌將固相上的抗原抗。? （四）免疫標(biāo)記技術(shù)? 1．免疫熒光法(immunofluorescence，IF) 此法乃用熒光素與抗體連接成熒光抗體，再與待檢標(biāo)本中抗原反應(yīng)，置熒光顯微鏡下觀察，抗原抗體復(fù)合物散發(fā)熒光，借此對抗原進行定性或定位。? 1．直接凝集 ? 2．間接凝集 ? 3．間接凝集抑制試驗 ? 各種凝集反應(yīng)示意圖? （二）沉淀反應(yīng)（掌握）? 可溶性抗原（血清蛋白質(zhì)、細(xì)胞裂解液或組織浸液、各種微生物蛋白分子等）與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在一定條件下出現(xiàn)肉眼可見的沉淀，此為沉淀反應(yīng)(precipitation)。放射免疫技術(shù)檢測放射性強度抗球蛋白試驗同上沉淀反應(yīng)液相沉淀試驗觀察沉淀，檢測濁度第一節(jié) 抗原抗體反應(yīng)的原理 抗原抗體反應(yīng):指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。C重組體載體自連目的基因 自連4. 人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接。重組DNA技術(shù)的基本原理重組DNA(rebinant DNA) 分子克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子——復(fù)制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或 DNA克隆) 。有了這些與親本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的結(jié)構(gòu)與功能，并可達到人為改造細(xì)胞以及物種個體的遺傳性狀的目的。? （6）離子強度影響。在低電壓時,線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。 ? （3）DNA分子的構(gòu)象。一個給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。經(jīng)過化學(xué)修飾的低熔點瓊脂糖，在較低的溫度下便會熔化，常用于DNA片段的制備電泳。例如，20%的聚丙烯酰胺凝膠可分離16bp的DNA小片段，而若要分離1000bp的DNA片段，就要用3%的聚丙烯酰胺凝膠。? 聚丙烯酰胺分離小片段DNA(5500bp)效果較好，其分辯力極高，甚至相差1bp的DNA片段就能分開。在適當(dāng)?shù)娜旧珬l件下，熒光強度與DNA片段的數(shù)量成正比。? 在凝膠電泳中，加入適量嗅化乙錠(ethidium bromide，簡稱EB)染料對核酸分子進行染色，然后將電泳標(biāo)本放置在紫外光下觀察，檢測靈敏快捷，可以清晰地檢測出來。這就是應(yīng)用凝膠電泳技術(shù)分離DNA片段的基本原理? 瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。根據(jù)分子大小、構(gòu)型或形狀的差異和帶凈電荷數(shù)，可通過電泳將蛋白質(zhì)或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離。 ? 基本原理 生物大分子在一定pH條件下，通常會帶電荷。? 如果采用兩種限制性內(nèi)切酶，必須要注意分別提供各自的最適鹽濃度。? 無論是用生物材料制備的天然DNA，還是化學(xué)合成的DNA，往往需要用限制性內(nèi)切酶進行切割，使其成為可用于連接重組的DNA片段?！　〔Ｆ汀∵@種芯片的點陣是通過原位合成技術(shù)制作的，點陣密度很高，所以必須借助于特殊的儀器對測定結(jié)果進行解讀和分析。支持物應(yīng)事先進行特定處理，例如包被以帶正電荷的多聚賴酸或氨基硅烷，以便能夠牢固地結(jié)合寡核苷酸分子。即，將墨盒中的墨汁分別用四種堿基合成試劑替代，支持物經(jīng)過包被后，通過計算機控制噴墨打印機將特定種類的試劑噴灑到預(yù)定的區(qū)域上。這樣，光通過蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羥基解保護，進而與單體分子共價結(jié)合。? 原位合成型 指根據(jù)預(yù)先設(shè)計的點陣序列在每個位點通過有機合成的方式直接聚合得到所要求的探針分子。二、基因分析芯片的簡要描述 1. 什么是基因芯片 基因芯片指對數(shù)以千記的DNA片段同時進行處理分析的技術(shù)，諸如基因組DNA突變譜和mRNA表達譜的檢測等（Trends in Biotechnology)。 熒光顯微鏡觀察雜交信號原位雜交技術(shù)在遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用? 中期及間期細(xì)胞遺傳學(xué)分析? 染色體結(jié)構(gòu)變異鑒定 ? 檢測基因擴增和缺失? 基因或者特異性DNA序列的定位 ? 染色體RNA和基因組進化的研究 五、生物芯片 生物芯片（biochip）是近年來在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來的一項高新技術(shù)，它主要是指通過微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA以及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速與大信息量的檢測。 原位雜交實驗最初的洗脫強度應(yīng)該低一些，有助于探針與目標(biāo)DNA形成專一性結(jié)合。雜交一般是在探針溫度大約在Tm25℃ （基因組原位雜交一般是37℃）、避光恒溫條件下進行，持續(xù)時間可以是1220小時，在此期間，要注意保濕。 制片DNA一般用70%去離子甲酰胺于70%下變性2分鐘即可。216。 50%甲酰胺，是解雙螺旋的分子，會破壞氫鍵的形成，促進DNA和探針變性后，進行雜交；216。 用RNA酶除去細(xì)胞質(zhì)中的RNA，避免其與探針DNA雜交。 染色體原位雜交要求高質(zhì)量的細(xì)胞學(xué)制片，因而需要最好的細(xì)胞分裂相。 末端標(biāo)記法 該標(biāo)記方法標(biāo)記的是線性DNA或RNA的5’端或3’端。 隨機引物法是近幾年來興起的一種有效的標(biāo)記方法，可與PCR技術(shù)方法結(jié)合進行引物的標(biāo)記。 切口平移法可對環(huán)狀或線性雙鏈DNA進行標(biāo)記。 ? 化學(xué)法是通過標(biāo)記物的活性基團與核酸分子