【正文】 1）材料的準(zhǔn)備由于實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，對于核酸提取材料的要求也不相同，①通常都要求材料新鮮無污染，這里所說的新鮮是指對采集得到的樣品應(yīng)立即進(jìn)行處理，對于暫時來不及處理的樣品應(yīng)該在適當(dāng)處理后冷藏保存。（二）分離提純核酸的基本要求但是無論采用哪一種方法，一般而言，一個好的核酸的分離提純方法都應(yīng)該符合三個基本要求：①所獲得的核酸純度應(yīng)該能夠滿足下游操作的要求，例如用于核酸組成和結(jié)構(gòu)分析的材料，對純度的要求很高，否則將可能影響分析結(jié)果，而對于用于PCR的核酸，通常純度要求不高，但是不得含有干擾PCR反應(yīng)的污染物；②所得到的核酸應(yīng)當(dāng)完整，電泳檢查時可以給出精確性高、重復(fù)性好的遷移帶型；③所得到的核酸應(yīng)有足夠的量。②針對某些特殊材料的方法，例如含多糖和多酚類物質(zhì)較多的植物材料，以及一些動植物蠟制標(biāo)本材料和毛發(fā)與角質(zhì)等材料，通常在提取核酸的過程中，要采用一些適當(dāng)?shù)拇胧?，消除多糖、多酚和角蛋白等的影響。一、核酸的提取核酸的分離與提純是核酸研究中最基本的技術(shù)，分離獲得的核酸質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗，但是不同的研究目的對核酸的純度和量的要求不盡相同。 核酸的發(fā)現(xiàn)與早期研究 ? 1944年 Avery等人證實(shí)DNA是遺傳物質(zhì)? 1953年 Watson和Crick發(fā)現(xiàn)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)? 1985年 Mullis發(fā)明PCR 技術(shù)? 2001年 美、英等國完成人類基因組計(jì)劃基本框架1978年Kan和Dozy首先應(yīng)用羊水細(xì)胞DNA限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）作鐮刀狀細(xì)胞貧血病的產(chǎn)前診斷，從而開創(chuàng)了DNA診斷的新技術(shù)。進(jìn)入20世紀(jì)70年代，隨著限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和DNA雜交技術(shù)的建立，核酸分子生物學(xué)進(jìn)入技術(shù)化時代。 雜交：不同來源的核酸經(jīng)變性和復(fù)性的過程，其中一些不同的核苷酸單鏈由于存在包括：DNA—DNA 雜交 DNA—RNA 雜交 RNA—RNA 雜交原因：不同核酸的堿基之間可以形成堿基配對用途：是分子生物學(xué)研究與基因工程操作的常用技術(shù) 核酸分子檢測技術(shù)核酸分子生物學(xué)自1953年Waston和Crick提出DNA雙螺旋模型，標(biāo)志著（核酸）分子生物學(xué)的創(chuàng)立。變性的DNA緩慢冷卻時可復(fù)性即 “退火”。 核酸的復(fù)性：變性核酸在一定條件下如溫度逐步恢復(fù)到生理范圍內(nèi)，兩條互補(bǔ)鏈重新恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象。變性產(chǎn)生增色效應(yīng)。、復(fù)性與雜交 核酸與核苷酸的主要性質(zhì)及其應(yīng)用 1 . 一般理化性質(zhì) 核酸為多元酸，具有較強(qiáng)的酸性；DNA是線性高分子，粘度極大；2. 紫外吸收性質(zhì) 在260nm波長有最大吸收峰，是由堿基的共軛雙鍵決定。 　 單鏈RNA自行盤繞形成局部雙螺旋區(qū)，在螺旋區(qū)，A與U配對，G與C配對。4. 維持雙螺旋穩(wěn)定的因素：橫向?yàn)闅滏I，縱向?yàn)閴A基間的堆積力。每圈螺旋含10個堿基對。螺旋直徑2nm，表面有大溝和小溝。 磷酸二酯鍵連接形成多核苷酸鏈，即核酸。 核苷酸之間以3 162。 核酸中核苷酸的排列順序。它是以DNA為模板，經(jīng)轉(zhuǎn)錄合成。轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸。蛋白質(zhì)合成場所，指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成。胸腺嘧啶嘌呤 嘧啶 堿基腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）尿嘧啶（U）DNA、RNA均有DNA有RNA有1 堿 基 嘌呤(purine)嘧啶(pyrimidine)戊 糖構(gòu)成RNA 構(gòu)成DNA核 苷：核苷 = 堿基 + 戊糖連接方式：糖苷鍵嘌呤環(huán)上的N9或嘧啶環(huán)上的N1與糖的C1’以糖苷鍵相連。DNA的基本組成單位是脫氧核糖核苷酸。DNA提取與測定及PCR分子生物學(xué)基礎(chǔ)核酸的組成、結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 核酸(nucleic acid)是體內(nèi)重要的生物大分子，由于最初從細(xì)胞核分離出來，又具有酸性，故稱為核酸。亦即當(dāng)你詳細(xì)觀察和描述一個未知菌種后，經(jīng)過認(rèn)真查找現(xiàn)有的權(quán)威性分類手冊，發(fā)現(xiàn)這是一個以往還未記載過的新種，這時就得按微生物的國際命名法規(guī)給以一個新的學(xué)名。將病原物的種類和病害種類同已知種類比較異同，確定其科學(xué)名稱或分類上的地位。理想的分類系統(tǒng)應(yīng)該是反映生物進(jìn)化規(guī)律的自然分類系統(tǒng)。 不論是傳統(tǒng)的常規(guī)檢測，還是現(xiàn)代的分子技術(shù)，一種有效的檢測方法都應(yīng)該具備以下3個條件：①專一性（specificity）強(qiáng)，這指的是檢測只對目標(biāo)分子或只對某一種有害生物分子產(chǎn)生陽性反應(yīng)；②靈敏度（sensitivity）高，是指即使只有微量的目標(biāo)分子，或是在有很多干擾存在的情況下，也能夠很靈敏地檢測出所尋找的那種有害生物的分子；③操作簡單（simplicity），主要是指在做大規(guī)模檢測時，要求能夠操作方便、簡單、高效、廉價。 分子檢測技術(shù)主要是指應(yīng)用分子生物學(xué)的方法來對有害生物進(jìn)行診斷檢測鑒定。 分子生物學(xué)研究表明，所有生命類型和不同物種差異的根源都是由遺傳物質(zhì)（DNA或RNA）決定的，而遺傳信息又是核酸上的核苷酸序列所決定的。這種診斷方法成本高、速度慢、效率低。 有害生物的傳統(tǒng)檢測鑒定，主要是從癥狀、形態(tài)鑒定、接種鑒別寄主、病原物培養(yǎng)性狀等方面來觀察有害生物所表現(xiàn)的表型和性狀來判斷，受環(huán)境因素，人為因素等多種因素的影響，往往影響對結(jié)果的準(zhǔn)確判斷。 檢測檢驗(yàn)是判斷一個樣品內(nèi)是否存在特定目標(biāo)病原物，而病害診斷是病害發(fā)生原因和性質(zhì)的鑒定。 動植物病原物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)是動植物檢疫工作的重要組成部分，在動植物、動植物產(chǎn)品及其他檢疫物的裝載容器、包裝物，以及來自動植物疫區(qū)的運(yùn)輸工具中是否有有害生物，或有害生物的種類與數(shù)量有多少，只有通過檢測才能知道。三、分子診斷技術(shù)概念：利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)方法，直接檢測基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對病害作出診斷的方法。分子生物學(xué)的基礎(chǔ)一、幾個簡單的問題？ 分子生物學(xué)是從分子水平研究生命本質(zhì)的一門新興邊緣學(xué)科，它以核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)、組成和功能，以及它們在遺傳信息和細(xì)胞信息傳遞中的作用等為研究對象，是當(dāng)前生命科學(xué)中發(fā)展最快并正在與其他學(xué)科廣泛交叉和滲透的前沿領(lǐng)域；它包括：a、研究核酸結(jié)構(gòu)及其功能的核酸分子生物學(xué)；b、研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的蛋白質(zhì)分子生物學(xué)；c、研究細(xì)胞信息傳遞與細(xì)胞信號傳導(dǎo)的細(xì)胞分子生物學(xué)等。③一種氨基酸可有多種密碼子。四、分子探針，特異性其特點(diǎn)：①三個相連核苷酸組成一個密碼子，編碼一個氨基酸，共有64個密碼子。 分子檢驗(yàn)檢測方法：快速，準(zhǔn)確等等，直接從遺傳物質(zhì)入手，根據(jù)核酸序列來檢測，既準(zhǔn)確又快速。 實(shí)現(xiàn)對檢疫性有害生物的快速檢測是當(dāng)前社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展的迫切需求。分子檢驗(yàn)檢測技術(shù)培訓(xùn)講義作者：日期：分子檢驗(yàn)檢測技術(shù)課程講義一、分子診斷又稱DNA診斷或基因診斷，是通過從生物體（比如疾病患者等）內(nèi)提取樣本用基因檢測方法來判斷該生物體是否有基因異常或攜帶有其它不應(yīng)該屬于該生物體的生物成份。 （檢測物）病原1 DNA 加熱 退火（降溫） 是否雜交（待檢物）病原2 DNA 加熱 退火（降溫）注意：用于分子檢測的器皿都需要消毒、滅菌所用水必須是雙蒸水、去離子水二、分子檢驗(yàn)檢測的意義 隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，國際國內(nèi)貿(mào)易的日趨頻繁，有害生物的擴(kuò)散加速，動植物檢疫工作越來越受到重視，由于檢疫性有害生物的擴(kuò)散造成的各類問題備受關(guān)注。三、分子檢驗(yàn)檢測與傳統(tǒng)檢驗(yàn)檢測方法的異同傳統(tǒng)檢驗(yàn)檢疫方法：耗時，專業(yè)要求高等等，主要是癥狀上判斷：同癥狀，多病原，疑難多，問題也多，耗時、耗材、耗力，對結(jié)果的準(zhǔn)確性影響很大，且對專家的要求很高。DNA序列的獨(dú)特性、專一性的檢測標(biāo)記進(jìn)行鑒定。②密碼子之間無核苷酸間隔。④所有生物使用同一套密碼子。 ？？？ ？？？幾級結(jié)構(gòu)？？各有什么功能和特性？ 二、核酸的理化性質(zhì) 1．粘度 2．紫外吸收 3．沉降系數(shù) 4．溶解性 5．變性和復(fù)性三、思考題 請簡述生物體、細(xì)胞、染色體、蛋白質(zhì)、核酸、基因等相互間的關(guān)系，并闡述分子檢驗(yàn)檢測的目標(biāo)對象。特點(diǎn)：針對性強(qiáng)、特異性高、靈敏度高、適用性強(qiáng)、診斷范圍四、分子診斷的常用技術(shù)方法 核酸分子雜交技術(shù) （restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析（allele specific oligonucleotide，ASO）雜交法聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基因測序基因芯片 動植物檢疫的理想目標(biāo)是：防止所有的檢疫性有害生物（物質(zhì)），人為跨境（國家或地區(qū)）傳播，并及時地發(fā)現(xiàn)、限制或鏟除外來的檢疫性有害生物。動植物檢驗(yàn)檢疫的目的就是要發(fā)現(xiàn)、檢查和鑒定有害生物，以作為出證放行或作進(jìn)一步檢疫處理的依據(jù)。 檢測檢驗(yàn)技術(shù)要求快速、準(zhǔn)確、靈敏、安全、高通量、簡便、易于標(biāo)準(zhǔn)化和推廣應(yīng)用。 此外，對于病害，許多傳統(tǒng)的診斷程序一般都涉及到兩個過程：第一，先要對病原物質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后再分析它的生理生化特性；第二，確定它到底是哪一類的病原物，是病毒、細(xì)菌還是其他的物質(zhì)。如果病原體生長特別慢或者根本無法通過人工培養(yǎng)的方法獲得，例如有些衣原體、植原體就不能培養(yǎng)或很難人工培養(yǎng)，那么這種傳統(tǒng)的診斷程序就很難有結(jié)果。因此最準(zhǔn)確的檢測鑒定方法，就是測定一些基于核酸序列的分子生物學(xué)檢測技術(shù)。從理論上講，任何一個決定特定生物學(xué)特性的DNA序列都應(yīng)該是獨(dú)特的，都可以用作專一性的檢測標(biāo)記，這就是分子診斷檢測鑒定的理論基礎(chǔ)。分類、鑒定、命名、診斷分類（classification）分類的任務(wù)是解決從個別到一般或從具體到抽象的問題，亦即通過收集大量有關(guān)個體描述的資料，經(jīng)過科學(xué)的歸納，整理成一個科學(xué)的分類系統(tǒng)。鑒定（identification） 鑒定的任務(wù)與分類恰恰相反，它是從一般到特殊或從抽象到具體的過程，亦即通過詳細(xì)的觀察和描述一個未知名稱純種生物的各種性狀特征，然后查找現(xiàn)成的分類系統(tǒng)，以達(dá)到知類辨名的目的。命名（nomenclature）命名的任務(wù)是為一個新發(fā)現(xiàn)的生物種確定一個新學(xué)名。診斷 （diagnosis）從癥狀等表型特征來判斷其病因，確定病害種類。核酸的基本組成單位是核苷酸 。RNA的基本組成單位是核糖核苷酸 。核苷酸核苷酸糖苷鍵酯鍵核苷酸：AMP, GMP, UMP, CMP脫氧核苷酸：dAMP, dGMP, dTMP, dCMP RNA和DNA中常見的核苷酸堿 基RNADNA腺嘌呤腺嘌呤核苷酸（腺苷酸，AMP）腺嘌呤脫氧核苷酸（脫氧腺苷酸，dAMP）鳥嘌呤鳥嘌呤核苷酸（鳥苷酸，GMP）鳥嘌呤脫氧核苷酸（脫氧鳥苷酸，dGMP）胞嘧啶胞嘧啶核苷酸（胞苷酸，CMP）胞嘧啶脫氧核苷酸（脫氧胞苷酸，dCMP）尿嘧啶尿嘧啶核苷酸（尿苷酸，UMP）胸腺嘧啶脫氧核苷酸（脫氧胸苷酸，dTMP）游離核苷酸及其衍生物多磷酸核苷酸環(huán)化核苷酸: cAMP，cGMP 核糖核酸（RNA）：遺傳信息的載體核糖體RNA（rRNA）:約占細(xì)胞中RNA總量的80%，是細(xì)胞質(zhì)中核糖體的組成成分。轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（t RNA ）:約占全部RNA的15%，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA是細(xì)胞中相對分子量最小的一種RNA分子，以游離態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。信使RNA（mRNA） : 占細(xì)胞中RNA總量的5%左右。轉(zhuǎn)錄遺傳信息。由于核苷酸間的差異主要是堿基不同，所以也稱為堿基序列。, 5 162。 DNA雙螺旋模型的基本要點(diǎn) 1. 兩條鏈反向平行，圍繞同一中心軸構(gòu)成右手雙螺旋 。2. 磷酸脫氧核糖骨架位于螺旋外側(cè)，堿基垂直于螺旋軸而伸入內(nèi)側(cè)。3. 兩條鏈通過堿基間的氫鍵相連，A對T有兩個氫鍵，C對G有三個氫鍵，嚴(yán)格按照堿基配對原則。 DNA的三級結(jié)構(gòu)指在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，DNA雙螺旋進(jìn)一步卷曲所形成的閉合環(huán)狀、線狀等超螺旋結(jié)構(gòu)。在3種RNA中，目前，研究最清楚的是tRNA的空間結(jié)構(gòu)，它的二級結(jié)構(gòu)均為三葉草形，三級結(jié)構(gòu)呈倒L形。這一特性常用作核酸的定性、定量分析。 核酸的變性：在某些理化因素作用下（溫度、酸堿、有機(jī)溶劑、尿素等），核酸分子互補(bǔ)雙鏈之間氫鍵斷裂，使雙螺旋結(jié)構(gòu)松散變成單鏈的過程。變性表征： 生物活性部分喪失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效應(yīng)） 變性因素： pH（）變性劑（脲、甲酰胺、甲醛）低離子強(qiáng)度、加熱 將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時，DNA不可能復(fù)性。 退火溫度＝Tm－25℃復(fù)性影響因素: 片段濃度/片段大小/片段復(fù)雜性（重復(fù)序列數(shù)目）/溶液離子強(qiáng)度復(fù)性特點(diǎn)：紫外吸收減少減色效應(yīng)：DNA復(fù)性過程中，紫外吸收減少的現(xiàn)象常用的復(fù)性方法：退火隨后，雙螺旋結(jié)構(gòu)創(chuàng)始人之一的Crick于1958年提出分子遺傳中心法則（central dogma），從而揭示了核酸與蛋白質(zhì)的內(nèi)在關(guān)系，以及RNA作為遺傳信息傳遞者的生物學(xué)功能以來發(fā)展迅速。之后，各種核酸分子生物學(xué)技術(shù)不斷出現(xiàn)，概括起來，主要包括核酸分子雜交（molecular hybridization of nucleic acids）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和DNA重組（rebinant DNA）技術(shù)等。二十多年來，DNA診斷技術(shù)取得了飛速的發(fā)展，建立了多種多樣的檢測方法，這些檢測方法