【正文】 明氨基酸接受臂在氨基?；途庉嫹磻械霓D(zhuǎn)位及作用；闡明延伸因子EFTu識別tRNALeu的機制；獲得LeuRS或它的結(jié)構(gòu)域與tRNALeu的共晶。2．完成LepA基因敲除模式生物的構(gòu)建。3．建立體內(nèi)蛋白質(zhì)巰基修飾的評價體系，闡述生理情況下蛋白質(zhì)巰基修飾對分子伴侶功能的影響和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化折疊的影響。4．鑒定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過氧化氫可能的代謝途徑及其在蛋白質(zhì)氧化折疊系統(tǒng)中的作用。4．解析12個Erv1Mia40系統(tǒng)的底物蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。5．闡明Tau、Prion蛋白病理性錯誤折疊和聚集的調(diào)控機制，以及分子伴侶在病變發(fā)生機制中的作用。獲得能夠有效干擾蛋白質(zhì)錯誤折疊和聚集的人工分子伴侶。6．初步認識翻譯后修飾及大分子擁擠在Prion蛋白傳播中的作用。闡明Hsp70與Prion蛋白及polyQ蛋白的相互作用，認識分子伴侶在Prion傳播所起的作用和對polyQ蛋白聚集的調(diào)控。7．初步認識細胞內(nèi)諸多因素對TDP43的細胞定位和包涵體形成的影響，以及TDP43功能喪失和產(chǎn)生細胞毒性的原因。闡明細胞內(nèi)RNA結(jié)合對TDP43功能病變過程中所起的作用。8．闡明甲醛應激下的過度磷酸化對神經(jīng)Tau蛋白、αSynuclein結(jié)構(gòu)與功能的影響；神經(jīng)Tau蛋白等過度磷酸化的生物學意義。闡明腦衰老及神經(jīng)退行疾病易感因素對αSynuclein等蛋白異常聚集、淀粉樣前驅(qū)蛋白（APP）代謝及Aβ異常折疊聚集的調(diào)控機制，解析腦衰老因素與蛋白質(zhì)異常修飾關系。闡明甲醛應激下GSK3b的過度磷酸化對線粒體動態(tài)平衡和功能的影響及其在老年癡呆發(fā)病中的作用。9．發(fā)表研究論文12篇以上。第四年1. 通過EcleuS溫度敏感性突變株KL231，通過體內(nèi)實驗揭示EcLeuRS在氨基?；途幮７磻袑RNA的識別特性。研究野生型和突變體hmtRNA接受莖活力，對編?；盍兔傅膭恿W常數(shù)的影響。研究EctRNALeu及其氨基酸接受臂上的點突變體在EcLeuRS所催化的轉(zhuǎn)移前和轉(zhuǎn)移后編校中的作用。2. 體外測定tRNALeuG37突變體或者各修飾形式的氨基酰化能力，探索其在編校過程中發(fā)揮的作用。3. 解析出LeuRS或它的結(jié)構(gòu)域與tRNALeu之間的共晶結(jié)構(gòu)，在原子水平上揭示LeuRS與tRNALeu的相互作用機制。4． 研究LepA在高等模式生物中的功能，包括通過體內(nèi)定點光交聯(lián)、化學交聯(lián)、免疫印跡、免疫共沉淀、串聯(lián)親和標簽技術結(jié)合質(zhì)譜等手段考察LepA/Guf1和其他因子的相互作用；通過體外翻譯體系研究其在高等生物核糖體上的功能。5．利用帕金森氏癥模型細胞檢測分子伴侶的巰基修飾對淀粉樣疾病的影響。6. 研究關鍵蛋白發(fā)生巰基修飾后對泛素化降解的調(diào)控機制。7. 利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的過氧化氫探針Hyper、氧化還原敏感的熒光蛋白roGFP在細胞水平檢查過氧化氫及巰基過氧化氫酶對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)氧化折疊和氧化還原平衡的影響。8．對Erv1到其底物蛋白的電子傳遞路徑進行研究。對線粒體中血紅素/銅轉(zhuǎn)運蛋白進行研究。9. 利用Hsp70的結(jié)構(gòu)域缺失突變體，研究它的三個結(jié)構(gòu)域在Prion傳播和治愈中各自的作用。10. 通過分子、細胞和動物模型檢測Htt及相關嵌合體的錯誤折疊和聚集性質(zhì)如何受Hsp70/HspHsp10GroEL和TriC等的調(diào)控。11. 以Atx3或aSyn蛋白為模型，研究雙功能輔伴侶蛋白通過分子伴侶和泛素蛋白酶體兩大系統(tǒng)對細胞中蛋白質(zhì)的質(zhì)和量的調(diào)控。12．通過“醛應激”細胞和動物模型，檢測甲醛誘導神經(jīng)元中GSK3β磷酸化位點及程度；GSK3β對線粒體動態(tài)平衡和轉(zhuǎn)運的影響，及在老年性癡呆癥模型所致神經(jīng)元凋亡和認知功能損傷中的作用；繼續(xù)研究內(nèi)源性甲醛與老年認知功能損傷之間關系。13．從細胞及整體水平研究腦衰老及神經(jīng)退行疾病易感因素對SNAREs及αSynuclein等蛋白質(zhì)異常修飾對突觸蛋白的組分變化及異常聚集，影響神經(jīng)遞質(zhì)外排功能、損傷突觸間聯(lián)絡，在探索蛋白質(zhì)異常修飾的機制及其相關網(wǎng)絡的相互作用及調(diào)控機制。14．研究BDNF改善神經(jīng)元和認知功能的關鍵通路，在體干預此信號通路后觀察對老年性癡呆動物模型的治療作用。1．揭示EcLeuRS體內(nèi)催化氨基?；途幮７磻臋C制；確定hmLeuRS識別hmtRNALeu的機理，闡明hmtRNALeu致病性點突變的致病機制；明確tRNALeuG37位對于酶與核酸體外相互作用的意義；解析出LeuRS或它的結(jié)構(gòu)域與tRNALeu的共晶結(jié)構(gòu)。2．通過體內(nèi)和體外實驗，篩選在高等生物中與LepA相互作用的蛋白因子，拓展對 LepA生理功能的認識。3．揭示分子伴侶的巰基修飾在淀粉樣疾病中的影響。獲得蛋白質(zhì)的巰基修飾對泛素化降解的調(diào)控機制。4．揭示過氧化氫及巰基過氧化氫酶對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)氧化折疊、氧化還原平衡中作用的分子機制。5．闡明12對Erv1與其底物蛋白的復合物的結(jié)構(gòu)并在原子分辨率水平上闡明電子傳遞的機理。解析12個血紅素/銅轉(zhuǎn)運蛋白或其復合物的晶體結(jié)構(gòu)并闡明其工作機理。6. 闡明Hsp70三個結(jié)構(gòu)域在Prion聚集和傳播過程中各自所起作用及其分子機制。7. 闡明某些分子伴侶和輔伴侶發(fā)揮作用的結(jié)構(gòu)基礎。認識分子伴侶和輔伴侶對錯誤折疊和聚集的調(diào)節(jié)。8. 揭示雙功能輔伴侶在分子伴侶和泛素蛋白酶體兩大系統(tǒng)中的橋梁作用，參與模型蛋白質(zhì)的質(zhì)和量的調(diào)控。9．闡明GSK3b在“醛應激”中的作用，即甲醛誘導細胞中GSK3β活性變化，GSK3β對線粒體動態(tài)平衡和轉(zhuǎn)運的影響，以及在老年性癡呆癥模型所致神經(jīng)元凋亡和認知功能損傷中的作用；初步闡釋內(nèi)源性甲醛與老年認知功能損傷之間關系。10．闡明腦衰老及神經(jīng)退行疾病易感因素對SNAREs及αSynuclein等蛋白質(zhì)異常修飾對突觸蛋白的組分變化及異常聚集，影響神經(jīng)遞質(zhì)外排功能、損傷突觸間聯(lián)絡機制；在探索蛋白質(zhì)異常修飾的機制及其相關網(wǎng)絡的相互作用的基礎上，闡明蛋白質(zhì)異常修飾與認知損傷之間的關系。11．發(fā)現(xiàn)通過干預激活BDNF信號通路治療老年性癡呆的有效手段。12. 發(fā)表研究論文13篇以上。第五年1. 基于前面幾年的實驗結(jié)果，詳細研究不同物種來源的LeuRS識別對應的tRNALeu的基礎，分析其中的規(guī)律。2. 建立tRNALeuG37甲基化修飾功能的體內(nèi)研究系統(tǒng)，從而在體內(nèi)闡明該位點的特定修飾的生理學意義。3. 繼續(xù)研究關于hmtRNA，重點研究tRNA的T莖環(huán)位置突變體，在獲得大量不同構(gòu)象的tRNA轉(zhuǎn)錄本基礎上篩選tRNA特異性結(jié)合蛋白質(zhì)。4. 在分子生物學和生物化學的層面研究LepA在高等生物中的功能和作用機理。5．在正常和應激條件下，通過已建立的蛋白質(zhì)組學檢測方法，比較Ure2存在、缺失以及處于Prion狀態(tài)時，酵母細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的亞硝基化和谷胱甘肽化修飾情況。6. 研究天然產(chǎn)物對蛋白質(zhì)質(zhì)量控制過程中關鍵蛋白巰基修飾的調(diào)控作用。7. 在細胞水平鑒定Ero1PDI、H2O2 Gpx7/Gpx8/Prx4PDI、QSOX等不同氧化折疊通路間的相互關系、巰基修飾發(fā)生的條件及對細胞生命活動的影響。8. 鑒定線粒體中Erv1Mia40系統(tǒng)的其他相關組分。9．在細胞和實驗動物模型上試驗影響蛋白質(zhì)聚集和包涵體形成的小分子化合物。10．綜合比較所研究的幾個模型蛋白質(zhì)的錯誤折疊、聚集和傳播的規(guī)律，構(gòu)建理化模型。11．綜合研究分子伴侶和輔伴侶及大分子擁擠對模型蛋白質(zhì)聚集、包涵體形成以及蛋白酶體降解的影響。12．研究“甲醛應激”導致蛋白質(zhì)異常磷酸化網(wǎng)絡調(diào)控機制，內(nèi)源性甲醛與老年認知功能障礙之間的關系。 13．臨床水平研究尋找APP 、Tau、αSynuclein及FTD43等蛋白異常折疊聚集與損傷突觸間聯(lián)絡影響神經(jīng)遞質(zhì)外排功能認知障礙的靶分子及生物標記物；臨床研究鑒定早期診斷蛋白質(zhì)修飾異常所致神經(jīng)退行疾病的內(nèi)源性甲醛等生物標記物與功能核磁相關新技術方法；尋找小分子及中藥天然物提取物早期干預上述靶分子。14．研究可阻斷甲醛應激導致GSK3b過度磷酸化的小分子多肽，在體給予此小分子多肽后觀察對老年性癡呆動物模型的治療作用。15．完成整個課題研究內(nèi)容和目標，總結(jié)五年工作，綜合本課題的研究成果。1．總結(jié)各種物種LeuRS與tRNALeu體內(nèi)與體外相互作用的特點，揭示其中的規(guī)律；明確tRNALeuG37位對于酶與核酸體內(nèi)相互作用的意義；篩選到hmtRNALeu特定突變體特異性結(jié)合蛋白質(zhì)，為揭示突變體的致病性機理提供線索。最終使我們從LeuRS和tRNALeu兩方面理解蛋白質(zhì)生物合成第一步反應氨基?；磻馁|(zhì)量控制機理。2．闡明LepA敲除的表型的內(nèi)在機理，即蛋白質(zhì)合成的受損與表型之間的關系，完成從宏觀整體（表型）到微觀機理（分子機制）系統(tǒng)認識LepA在高等生物中的生理功能。3．闡釋Ure2的GRX活性可能的生理功能。4．篩選具有調(diào)控功能的天然小分子藥物先導物。5．明確EroPDI、GpxGpxPrx4在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)氧化折疊系統(tǒng)中的地位及聯(lián)系。6．完善線粒體中Erv1Mia40系統(tǒng)的工作機理。7．爭取獲得一個在細胞模型上能夠有效干擾包涵體形成的小分子化合物。8. 獲得蛋白質(zhì)錯誤折疊、聚集和傳播的合理模型。9. 清楚認識分子伴侶和輔伴侶及大分子擁擠在蛋白質(zhì)聚集、包涵體形成以及降解過程中所起的作用。10．研究出能夠試用于臨床診斷老年性癡呆癥的生物標記物。闡明內(nèi)源性甲醛與老年認知功能障礙之間的關系；建立臨床檢驗老年性癡呆癥的生物化學方法，為將來發(fā)展成為用于臨床診斷和藥物使用的評價指標的新方法打下基礎。11．尋找臨床可應用的APP 、αSynuclein及FTD43等蛋白異常折疊聚集與損傷突觸間聯(lián)絡影響神經(jīng)遞質(zhì)外排功能認知障礙的易感因素及生物標記物；臨床研究鑒定早期診斷蛋白質(zhì)修飾異常所致神經(jīng)退行疾病的內(nèi)源性甲醛等生物標記物與功能核磁相關新技術方法；尋找和鑒定早期干預蛋白異常修飾靶分子及易感因素的小分子化合物。12．通過阻斷應激導致GSK3b的過度磷酸化，發(fā)現(xiàn)治療老年癡呆的手段。13．發(fā)表研究論文12篇以上。5年總體預計項目在國際專業(yè)學術刊物上將發(fā)表研究論文5080篇，其中影響因子大于10 的研究論文510篇。申請專利35項。26 / 26