【正文】 凝膠電泳方法分析膠原蛋白樣品。首先稱取 g 膠原蛋白樣品溶解在 10 mL 的 mol/L TrispH 1% SDS 緩沖液中，過夜在 5000 轉(zhuǎn)/分離心 5 分鐘。上清液與 2樣品緩沖混合( mol/L Tris，4% SDS，20%甘油，2% β巰基乙醇， %溴酚籃)混合。90℃加熱變性 5 分鐘冷卻備用。制膠：濃縮膠濃度為 %，分離膠濃度為 5%，電極緩沖為 mol/L Tris，% SDS， M 甘氨酸，上樣量為 10 μL，在 4060 v 電壓條件下跑完電泳，電泳后染色用 % R250，50%甲醇，10%醋酸染色。用 5%甲醇，%醋酸脫色。Highmolecularweight markers(Sigma，USA)作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。2 結(jié)果和分析 預(yù)處理的脫色效果 由表 23 不同濃度氫氧化鈉脫色效果可以看出：在 20 ℃條件下，含有 1％ H 2O2的不同濃度的氫氧化鈉溶液中，在中性條件下，雙氧水無脫色效果。氫氧化鈉濃度從 mol/L－ mol/L，脫色速度越來越快，脫色反應(yīng)越來越強(qiáng)烈。在含 1％雙氧水 mol/L 的氫氧化鈉溶液中，魚皮浮在溶液表面，黑色素逐漸退去，最終少量魚皮上殘留黑色素。魚皮在含有 1％雙氧水氫氧化鈉濃度 mol/L－ mol/L溶液中，魚皮上的黑色素體很快轉(zhuǎn)變?yōu)榈S色，6 個(gè)小時(shí)以后淡黃色的色素體逐漸溶表 23 不同濃度氫氧化鈉脫色效果Table 23 Effects of removing pigment on different NaOH concentrations氫氧化鈉濃度( mol/L) 3 小時(shí)脫色情況 6 小時(shí)脫色情況 24 小時(shí)脫色情況1 0 無變化 無變化 無變化2 無現(xiàn)象 黑色素逐漸褪去呈 淡灰色 魚皮形態(tài)保持原狀，黑色素褪去少數(shù)魚皮上有黑色素殘留，溶液淡黑3 魚皮上黑色素轉(zhuǎn) 變?yōu)闇\黃色 約有 70％黃色褪去 魚皮呈潔白半透明，溶液為黃色第二章 草魚皮提取膠原蛋白工藝條件研究134 魚皮上黑色素轉(zhuǎn) 變?yōu)辄S色 約有 80％黃色褪去 魚皮呈潔白半透明，溶液為黃色5 魚皮上黑色素轉(zhuǎn) 變?yōu)辄S色 約有 90％黃色褪去，溶液為淡黃色 魚皮呈潔白半透明，溶液為黃色由表 23 不同濃度氫氧化鈉脫色效果可以看出：在 20 ℃條件下，含有 1％ H2O2的不同濃度的氫氧化鈉溶液中，在中性條件下，雙氧水無脫色效果。氫氧化鈉濃度從 mol/L－ mol/L，脫色速度越來越快，脫色反應(yīng)越來越強(qiáng)烈。在含 1％雙氧水 mol/L 的氫氧化鈉溶液中，魚皮浮在溶液表面，黑色素逐漸退去，最終少量魚皮上殘留黑色素。魚皮在含有 1％雙氧水氫氧化鈉濃度 mol/L－ mol/L溶液中，魚皮上的黑色素體很快轉(zhuǎn)變?yōu)榈S色，6 個(gè)小時(shí)以后淡黃色的色素體逐漸溶解在溶液中，溶液發(fā)黃，最后仍然還有少量魚皮上有淡黃色。在 20 ℃條件下，含 %、1%、2%、3%過氧化氫的 mol/L 氫氧化鈉溶液中，魚皮形態(tài)保持原狀，黑色素逐漸褪去，脫色的速率無差別，最終少數(shù)魚皮上有黑色素殘留。所以，過氧化氫濃度對(duì)脫色無明顯影響，而氫氧化鈉濃度越高，脫色速度越快，反應(yīng)也越劇烈。 預(yù)處理的脫雜蛋白效果0%2%4%6%8%10%12%14%16%0 氫 氧 化 鈉 濃 度 (mol/L)蛋白質(zhì)溶解率(％)圖 25 在含 1％ H 2O2的不同濃度氫氧化鈉溶液中蛋白質(zhì)的溶解率Figure25 Dissolve rate of protein in different NaOH concentrations solution contain 1% H2O2 圖 25 顯示了不同濃度氫氧化鈉的脫蛋白效果：在 20 ℃條件下，含 1％過氧化氫的不同濃度的氫氧化鈉溶液中：對(duì)照水中，蛋白質(zhì)無法溶解，氫氧化鈉濃度從草魚皮膠原蛋白的制備及性質(zhì)研究14 mol/L－ mol/L，蛋白質(zhì)溶出率逐漸提高，而羥脯氨酸含量均低于 1％（數(shù)據(jù)未顯示）。 mol/L－ mol/L 氫氧化鈉能夠有效的去除魚皮中的非膠原蛋白，但是氫氧化鈉濃度越高，有可能導(dǎo)致高分子量鍵的斷裂，同時(shí)可能導(dǎo)致膠原蛋白的降解在堿性預(yù)處理溶液中。所以，在 20 ℃，選擇低濃度氫氧化鈉去脫雜蛋白，同時(shí)對(duì)膠原蛋白性質(zhì)影響也最小。0%2%4%6%8%10%0% 1% 2% 3% 4%過 氧 化 氫 濃 度 (％ )蛋白質(zhì)溶解率(％)圖 26 在含不同濃度 H2O2的氫氧化鈉溶液（ mol/L）中蛋白質(zhì)溶解率Figure26 Dissolve rate of protein in mol/L NaOH with different H2O2 concentration圖 26 顯示了不同濃度氫氧化鈉的脫色素效果：在 20 ℃條件下，含%、1%、2%、3%過氧化氫的 mol/L 氫氧化鈉溶液中，蛋白質(zhì)的溶解率都在%左右，說明過氧化氫的濃度，對(duì)蛋白質(zhì)的溶解率幾乎沒有影響。 預(yù)處理對(duì)膠原蛋白溶解性的影響由圖 27 可以看出：樣品 1：在 4 ℃，1%過氧化氫， mol/L 的氫氧化鈉脫色處理草魚皮 24 小時(shí)后，然后在加酶的醋酸溶液中，48 小時(shí)提取率為 %，樣品1 的提取率在整個(gè)過程中都略高于樣品 2（4 ℃， mol/L NaOH）和樣品 3(20 ℃， mol/L NaOH)。樣品 4：在 20 ℃，1%過氧化氫、 mol/L 的氫氧化鈉脫色處理 24 小時(shí)后，即使在加酶的醋酸中，提取 48 小時(shí)，提取率也只有 8％。說明在此條件下，膠原蛋白之間發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)，生成了胃蛋白酶也無法剪切的交聯(lián)鍵，導(dǎo)致膠原蛋白無法溶解。第二章 草魚皮提取膠原蛋白工藝條件研究150%20%40%60%80%100%0 10 20 30 40 50 60時(shí) 間 (h)膠原蛋白溶解率（％）圖 27 不同脫色處理后對(duì)膠原蛋白溶解率的影響，不同脫色處理：◆：在 4 ℃， mol/L 的氫氧化鈉處理，■：在 4 ℃， mol/L NaOH 處理，▲：在 20 ℃，●：在 20 ℃， mol/L NaOH 處理Figure27 Effects to collagen rate after different treatments of taking off pigment，different treatments of taking off pigment: ◆：at 4 ℃，condition，■：at 4 ℃， mol/L NaOH condition，▲：at 20 ℃， mol/L NaOH condition，●：at 20 ℃， mol/L NaOH condition. 預(yù)處理的脫脂效果與常規(guī)脫脂效果比較0%10%20%30%40%50%60%70%80%常 規(guī) 脫 脂 處 理 1 處 理 2脫脂率（％）圖 28 脫脂效果比較，常規(guī)脫脂：10%正丁醇，處理 1： mol/L NaOH 含 1％ H202，處理2： mol/L NaOH 含 1％ H 202，均質(zhì)figure28 Comparison defatted effect，conventional defatted treatment：10% butyl 草魚皮膠原蛋白的制備及性質(zhì)研究16alcohol，treatment1: mol/L NaOH contain 1％ H202，treatment2: mol/L NaOH contain 1％ H 202 and homogenized常規(guī)脫脂的脫脂率約為 57％，脫色處理 1，在 20 ℃，含 1％H 202 mol/L NaOH 溶液中處理 24 小時(shí)脫脂率為約為 56％，脫色處理 2 是在處理 1 后再用食物攪拌機(jī)(Philips，HR2964)高速攪打 2 分鐘，脫脂率約為 70％，比常規(guī)脫脂和處理 1 約高 14％，均質(zhì)明顯提高了魚皮的脫脂率，同時(shí)還可以除去魚皮上殘留的色素。NaOH和 H202脫脂的機(jī)理，可能是 H202于脂肪發(fā)生了氧化發(fā)應(yīng)，有利于脂肪的溶出。 膠原蛋白提取條件研究 魚皮膠原蛋白在醋酸溶液中溶解性0%20%40%60%80%100%0 10 20 30 40 50 60 70時(shí) 間 （ h）膠原蛋白溶解率（％）圖 29 在不同溫度條件下醋酸提取膠原蛋白溶解率隨時(shí)間變化曲線◆：4 ℃，■：20 ℃，▲：30 ℃Figure29 Change curves of acid soluble collagen dissolve rate on different temperatures by time ◆：4 ℃，■：20 ℃，▲：30 ℃在不同溫度條件下，草魚皮在醋酸溶液中有良好的膨脹性能，這是膠原蛋白溶解的中間狀態(tài)。由圖 2－9 草魚皮在不同溫度醋酸溶液中溶解率隨時(shí)間變化曲線可以看出：在 4 ℃，在 mol/L 的醋酸溶液中提取 64 小時(shí)，草魚皮膠原蛋白溶解了35％左右。在相同的時(shí)間里，20 ℃溶解了 80％左右，30 ℃溶解了 87％左右。與豬皮相比，在 20 ℃、 mol/L 的醋酸溶液中提取 64 小時(shí)，溶解率只有 5％，所以，第二章 草魚皮提取膠原蛋白工藝條件研究17草魚皮膠原蛋白易溶解在醋酸溶液中。在 4 ℃，隨著時(shí)間增加溶解率不斷上升。在20 ℃，65％膠原蛋白在提取的前 36 小時(shí)溶解，然后溶解變緩慢，在 30 ℃，75％左右膠原蛋白在提取的前 12 小時(shí)溶解，然后溶解變緩慢。所以，溫度對(duì)膠原蛋白提取影響很明顯，溫度越高，溶解的越快，溶解率也越高。另外溫度是否導(dǎo)致膠原蛋白降解后面討論。 魚皮膠原蛋白在醋酸＋酶溶液中的溶解性0%20%40%60%80%100%0 10 20 30 40 50 60 70時(shí) 間 （ h）膠原蛋白溶解率（％）圖 210 在不同溫度條件下醋酸加酶提取膠原蛋白溶解率隨時(shí)間變化曲線，◆：4 ℃，■：20 ℃，▲：30 ℃Figure210 Change curves of acid+pepsin soluble collagen dissolve rate on different temperatures by time，◆：4 ℃，■：20 ℃，▲：30 ℃圖 2－10 顯示了草魚皮在不同溫度醋酸＋胃蛋白酶溶液中溶解率隨時(shí)間變化曲線可以看出，在 4 ℃，在 mol/L 的醋酸＋胃蛋白酶溶液中提取 64 小時(shí)，草魚皮膠原蛋白溶解了 65％左右。在相同的時(shí)間里，20 ℃和 30 ℃溶解了 87％左右。在 4 ℃，醋酸＋胃蛋白酶溶液中提取率是醋酸溶液提取率的兩倍多，在 20 ℃和 30 ℃，加胃蛋白酶提取率也高于在醋酸中的。所以，加胃蛋白酶的膠原蛋白提取率高于在醋酸中提取率。在 4 ℃ ，隨著時(shí)間增加溶解率不斷上升。在 20 ℃，78％膠原蛋白在提取的前 36 小時(shí)溶解，然后溶解變緩慢，在 30 ℃，70％左右膠原蛋白在提取的前 12 小時(shí)溶解，然后溶解變緩慢。所以，溫度對(duì)加胃蛋白酶醋酸溶液提取膠原蛋白也有很大影響。溫度越高，提取率越高。溫度是否導(dǎo)致膠原蛋白降解后面討論。 膠原蛋白肽鏈組成草魚皮膠原蛋白的制備及性質(zhì)研究18圖 211 在 4 ℃條件下醋酸和醋酸＋酶提取膠原蛋白的 SDSPAGE 電泳圖，醋酸提取膠原蛋白(AS)：B，6 小時(shí)，C，12 小時(shí)，D，24 小時(shí)，E，36 小時(shí)，F(xiàn)，48 小時(shí)，醋酸加酶提取膠原蛋白(PS)：b，6 小時(shí)，c，12 小時(shí)，d，24 小時(shí)，e，36 小時(shí)，f，48 小時(shí)Figure212 SDS polyacrylamide gel electrophoresis of acid and acid+pepsin soluble collagens at condition of temperature 4 ℃，acid soluble collagen(AS)：B，6h，C，12 h，D，24 h，E，36 h，F(xiàn)，48 h，acid+pepsin soluble collagen(PS)：b，6 h，c，12 h，d，24 h，e，36 h，f，48 h圖 212 在 20 ℃條件下醋酸和醋酸＋酶提取膠原蛋白的 SDSPAGE 電泳圖，醋酸提取膠原蛋白(AS)：B，6 小時(shí)，C，12 小時(shí)，D，24 小時(shí)，E，36 小時(shí)，F(xiàn)，48 小時(shí)，醋酸加酶提取膠原蛋白(PS)：b，6 小時(shí)，c，12 小時(shí)，d，24 小時(shí)，e，36 小時(shí)，f，48 小時(shí)Figure212 SDS polyacrylamide gel electrophoresis of acid and acid+pepsin soluble collagens at condition of temperature 20 ℃， acid soluble collagen(AS)： B，6 第二章 草魚皮提取膠原蛋白工藝條件研究19h，C，12 h，D，24 h，E，36 h，F(xiàn)，48 h，acid+pepsin soluble collagen(PS)：b，6 h，c，12 h，d，24 h，e，36 h，f，48 h圖 213 在 30 ℃條件下醋酸和醋酸＋酶提取膠原蛋白的 SDSPAGE 電泳圖，醋酸提取膠原蛋白(AS)：M，marker，C，12 小時(shí)，D，24 小時(shí)，E，36 小時(shí)，F(xiàn)，48 小時(shí)，醋酸