【正文】 德國Eppendorf公司旋窩混勻器 上海XW80A101A3ET電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海實驗儀器廠有限公司DK8D型電熱恒溫水槽 上海精宏實驗設(shè)備有限公司TD恒溫萬用電爐 鞏義英峪予華儀器廠節(jié)能型智能恒溫槽 新芝生物科技股份有限公司80℃ Thermo 武漢赤誠生物技術(shù)有限公司亞西牌液氮生物容器 四川亞西橡塑機器有限公司超純水儀 上海睿浦實業(yè)有限公司手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器 上海三申醫(yī)療機械有限公司SPX150BSⅡ生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司GJ1000高壓氣體基因槍 寧波新芝生物科技股份有限公司熒光顯微鏡 Olympus公司 溶液配制1. LB培養(yǎng)基：蛋白胨1%，%，NaCll%，；固體LB培養(yǎng)基另%的瓊脂粉， ，高壓蒸汽滅菌20分鐘；冷卻至50℃后加Pa510?入相應(yīng)抗生素，倒平板。2. 電泳液：TAE緩沖液。3. 凝膠配制：TAE緩沖液，%。()：，KCl ，Na 2HPO4 ，KH 2PO4 ，加ddH 2O至 1000ml。：1L MS培養(yǎng)基加入大量元素（20）50ml，微量元素（100）10ml，鐵鹽（100）10ml，有機成分（100）10ml,鈣鹽（20）50ml，蔗糖30g。用NaOH調(diào)節(jié)PH=。 擴增含有酶切位點的MYB1基因 質(zhì)粒的提?。?）選擇一管陽性擴增的菌液，吸取100 接菌于20 含AMP的液體LB培養(yǎng)l?ml基中，37℃搖床至OD=(約46h)。（2）將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)到 ml 離心管中，12022 r/min 離心 1 min，倒掉上清液，最后吸干菌液。（3）加入 100 μl 溶液 I，重懸細胞。溶液 I：50 mmol/L TrisC（）, 10 mmol/L EDTA（） 。（4）加入 200 μl 的溶液 II，輕輕振蕩 4～5 次，室溫靜置 23 min。溶液 II： mol/L NaOH（10 mol/L 貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋） ，1% SDS。（5）加入 150 μl 溶液 III，振蕩 4～5 次，冰浴 10 min, 4℃，12022 r/min 離心 5min。溶液 III：5 mol/L 乙酸鉀 60 ml, 冰乙酸 ml, 無菌水 ml。（6）將上清液轉(zhuǎn)入一新離心管，加入 RNase 2 μl，37℃，水浴 3 h。（7）加入等體積的苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1） ，振蕩 4～5 次，4℃ 12022r/min 離心 5 min（如果蛋白多可抽提 2 遍)。（8）吸取上清液轉(zhuǎn)入 ml 離心管中，加入 2 倍體積的預(yù)冷無水乙醇，在－20℃冰箱中放置 30 min 以上。（9）4℃ 12022 r/min 離心 10 min，倒掉上清液，吸干酒精，用 70%酒精洗滌沉淀 2 遍，真空干燥。（10）用加有 RNAase 的 TE 緩沖液 15～20 μl 溶解沉淀。取 2 μl 用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，質(zhì)粒20℃保存。TE 緩沖液：10 mmol/L TrisHCl ()，1 mmol/LEDTA()。 以質(zhì)粒為模板擴增含有酶切位點的MYB1基因以重組質(zhì)粒T+MYB1為模板， 和 為特異性引物，F(xiàn)MYB亞?1FYB亞?1按照類似MYB1的擴增體系與程序，擴增含有酶切位點的MYB1基因。⑴PCR反應(yīng)體系①PCR反應(yīng)體系: OdH2 l?.918 bufer?1052 NTP4 FMYB亞??8 R亞1l. )1(亞?Templat 0 qDNAolyersl?6.總體積 25②PCR循環(huán)條件:95℃預(yù)變性6min，94℃變性40s，55℃退火40s，72℃延伸90s，共30個循環(huán)，72℃延伸1Omin，10min降溫至16℃。⑩ %瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察。⑵割膠目的基因片段(亞MYB1)應(yīng)用申能博彩生物科技有限公司提供的DNA試劑盒回收目的片段，具體操作步驟按照回收試劑盒的說明進行。⑶擴增片段的回收步驟：①切割目的片段條帶，將膠置于EP管中；②每100 膠液加入500 SN后，置于65℃水浴鍋中水浴5min，然后加入l?l?50 SB； 將3S柱放入2ml收集管中，將融化的膠液移入3S柱中，蓋子打開。室溫放置2min，蓋上蓋子，10000g離心1min； 取下3S柱，倒廢液，將3S柱放入回收管，加600 wash solution，10000gl?離心1min； 重復(fù)③步驟； 倒廢液，10000g離心2min； ，在柱子膜中央加30 TE（預(yù)先65℃水浴加熱） ，l?放置2min； 12022g離心2min。 含有酶切位點的MYB1基因與pMD18T質(zhì)粒的連接①同上述與pMD18T質(zhì)粒的連接的原理一樣，利用以下鏈接體系將含有酶切位點的MYB1基因與pMD18T質(zhì)粒的連接。連接體系： TpMD?18SimpleVctorl? 含 特 異 引 物 的 NA69 Solutin? l1總體積 ?20② 反應(yīng)條件：16℃水浴連接過夜。 重組子轉(zhuǎn)化 感受態(tài)細胞?5DH（1）將裝有 100 感受態(tài)細胞的 ml 離心管置于冰l?5上，讓其在冰浴中微溶。（2）加入 20 連接反應(yīng)液，輕輕混勻后，冰浴 30 min。l（3）42℃水浴中熱激處理 90 s。（4）快速冰浴冷卻 1～2 min。（5）加入 400 LB 液體培養(yǎng)基，37℃，200 r/min 搖動 45 min 以上，l?室溫，4000g 離心 2 min，棄去 400 的上清液，重懸沉淀菌體，然后涂布l?于含有 100 μg/mlAmp 的 LB 固體平板上，37℃培養(yǎng) 16～18 h。 挑斑篩選陽性克隆選擇在涂有AMP的LB平板上生長良好、色澤圓潤的白色菌斑，挑取8個單克隆至含有 Amp（100 μg/ml）的 LB 液體培養(yǎng)基的EP管中，作好標記；37 ℃、280 r/min 培養(yǎng)至OD=(約23h)。然后進行菌液PCR和質(zhì)粒酶切鑒定。 菌液PCR鑒定①PCR反應(yīng)體系: OdH2 l?.918 bufer?1052 NTP4 FMYB亞??8 R亞1l. )(菌 液Templat 0 qDNAolyersl?6.總體積 25② PCR循環(huán)條件:95℃預(yù)變性6min，94℃變性40s，55℃退火40s，72℃延伸90s，共30個循環(huán)，72℃延伸1Omin，10min降溫至16℃。③ %瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察。 T+MYB1重組子的酶切鑒定① 根據(jù)菌液PCR的結(jié)果，選取3號管，接菌100 與10mlLB液體培養(yǎng)基中，l?搖床培養(yǎng)到一定濃度后，在進行雙酶切驗證。酶切體系： 118???MYBTpMD含 特 異 引 物 的 ul24 ?coN .51 eS l Bufr?10angou3總體積 30 l?② 酶切條件：37℃水浴，酶切46h。③ %瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收小片段。 亞細胞定位載體質(zhì)粒pCAMBIA1304的雙酶切① 以同樣的兩種酶 和 酶切質(zhì)粒pCAMBIA1304；?coNpeS圖 13 載體質(zhì)粒pCAMBIA圖片酶切體系： 質(zhì) 粒4pCAMBI130ul24 ? eS l ufr?10Tangou3總體積 30 l?② 酶切條件：37℃水浴，酶切46h。③ %瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收大片段。 目的基因與pCAMBIA1304質(zhì)粒的連接① 連接體系： 大 片 段4pCAMBI130l?.53 ?Y含 特 異 引 物 的 1 4TDNligasel bufr2 40PEGl?總體積 20 ② 酶連條件：16℃水浴，連接過夜。 重組子轉(zhuǎn)化 感受態(tài)細胞 14pCAMBI130??myb?5DH重組子轉(zhuǎn)化 感受態(tài)細胞的步驟：?5DH（1）將裝有 100 感受態(tài)細胞的 ml 離心管置于冰l?上，讓其在冰浴中微溶。（2）加入 20 連接反應(yīng)液，輕輕混勻后，冰浴 30 min。l（3）42℃水浴中熱激處理 90 s。（4）快速冰浴冷卻 1～2 min。（5）加入 400 LB 液體培養(yǎng)基，37℃，200 r/min 搖動 45 min 以上，l?室溫，4000g 離心 2 min，棄去 400 的上清液，重懸沉淀菌體，然后涂布l?于含有 100 μg/mlAmp 的 LB 固體平板上，37℃培養(yǎng) 16～18 h。 挑斑篩選陽性克?、?選擇在涂有AMP的LB平板上生長良好、色澤圓潤的白色菌斑，挑取8個單克隆至含有 Amp（100 μg/ml）的 LB 液體培養(yǎng)基的EP管中，作好標記；② 37 ℃、280 r/min 培養(yǎng)至OD=(約23h)。然后進行菌液PCR和質(zhì)粒酶切鑒定。 菌液PCR鑒定① PCR反應(yīng)體系: OdH2 l?.918 bufer?1052 NTP4 FMYB亞??8 R亞1l. )(菌 液Templat l? qDNAolyers6總體積 l25② PCR循環(huán)條件:95℃預(yù)變性6min，94℃變性40s，55℃退火40s，72℃延伸90s，共30個循環(huán)，72℃延伸1Omin，10min降溫至16℃。③ %瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察。 重組子的酶切鑒定14pCAMBI130??Y① 根據(jù)菌液PCR的結(jié)果，選取3號管，接菌100 與10mlLB液體培養(yǎng)基中，l?搖床培養(yǎng)到一定濃度后，按照上述步驟提取質(zhì)粒，在進行雙酶切驗證。酶切體系： 11304??YBpCAI ul13 ?coN eS l Bufr?總體積 16 l?② 酶切條件：37℃水浴，酶切46h。③ %瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收小片段。④ 選擇陽性菌液接菌，提質(zhì)粒，酶切驗證。 提取陽性菌液的質(zhì)粒質(zhì)粒的小量提取方法為：（1）選擇一管陽性擴增的菌液，吸取100 接菌于20 含AMP的液體LB培養(yǎng)l?ml基中，37℃搖床至OD=(約46h)（2）將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)到 ml 離心管中，12022 r/min 離心 1 min，倒掉上清液，最后吸干菌液。（3）加入 100 μl 溶液 I，重懸細胞。溶液 I：50 mmol/L TrisC（）, 10 mmol/L EDTA（） 。（4）加入 200 μl 的溶液 II，輕輕振蕩 4～5 次，室溫靜置 23 min。溶液 II： mol/L NaOH（10 mol/L 貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋） ，1% SDS。（5）加入 150 μl 溶液 III，振蕩 4～5 次，冰浴 10 min,