【正文】 122A83C2擴(kuò)大培養(yǎng)，72h后，收集細(xì)胞上清1000 mL。用3 mL Ni Sepharose 6 FF層析柱親和層析純化，更換緩沖液后，得到12ml目的蛋白溶液。對純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS–PAGE電泳和Western blotting分析（圖10），結(jié)果顯示重組蛋白純化效果較好，灰度分析顯示其純度為95%，無其他雜帶，純化后蛋白濃度明顯大于純化前。圖 10 Ni Sepharose 6 FF柱層析純化gBt蛋白的SDS–PAGE分析A ： SDS–PAGE1：標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白marker2：BSA（1mg/mL）3：純化后的gBt蛋白B ：Western blotting 1：標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白marker 2：轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pMCE5細(xì)胞上清，陰性對照 3：純化前的gBt蛋白4：純化后的gBt蛋白HiTrap SP HP（5ml）離子交換層析純化鑒定用無血清培養(yǎng)基CD CHO Medium+L–Glutamine（終濃度8 mM/L），擴(kuò)大培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株HSV I gB1D122A83C2，培養(yǎng)72h，收集細(xì)胞上清1000 mL。用離子交換柱HiTrap SP HP（5ml）層析， mol/L ~ mol/L 濃度NaCl洗脫，收集到20ml蛋白溶液； mol/LNaCl洗脫收集到30ml蛋白溶液。將蛋白溶液進(jìn)行超濾離心脫鹽處理。對純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS–PAGE電泳和Western blotting分析（圖11），結(jié)果顯示細(xì)胞表達(dá)上清經(jīng)純化后在85kDa處有蛋白條帶，分子量與陽參蛋白（取第三次克隆化的C2孔細(xì)胞上清）一致，但雜帶較多純度不高?；叶确治鲲@示， mol/L NaCl洗脫組分目的蛋白純度為15%， mol/L ~ mol/L NaCl洗脫組分目的蛋白純度為30%， mol/LNaCl， mol/L ~ mol/L NaCl洗脫目的蛋白效果更好。 圖 11 HiTrap SP HP柱層析純化gBt蛋白的SDS–PAGE和 Western blotting分析M：標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白marker1： mol/L ~ mol/L NaCl洗脫組分2： mol/L NaCl洗脫組分P：陽參蛋白兩步層析法純化鑒定（1）第一步，HiTrap SP HP（5ml) 離子交換層析用含10%FBS的DMEM/F12 培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株HSV I gB1D122A83C2，培養(yǎng)72h，收集細(xì)胞上清1000 mL。經(jīng)離子交換柱HiTrap SP HP（5ml）層析，、 mol/L NaCl、 mol/L 、 mol/L NaCl梯度洗脫，收集洗脫組分，進(jìn)行SDS–PAGE電泳和Western blotting分析（圖12）。（2）第二步，方案Ⅰ: HiTrap Phenyl FF（1ml）離子交換層析，取第一步層析洗脫的活性組份10ml上柱純化。收集洗脫組分，更換緩沖液后進(jìn)行SDS–PAGE電泳和Western blotting分析（圖13）；方案Ⅱ: Lentil lectin Sepharose 4B（1ml）外源凝集素親和層析，取第一步層析洗脫的活性組份10ml上柱純化。收集洗脫組分，更換緩沖液后進(jìn)行SDS–PAGE電泳和Western blotting分析（圖14）；方案Ⅲ: HiTrap Q HP（5ml）離子交換層析，取第一步層析洗脫的活性組份60ml上柱純化，收集洗脫組分，更換緩沖液后對純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS–PAGE電泳和Western blotting分析（圖15）。結(jié)果顯示：純化含10%血清培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)上清，兩步串聯(lián)純化三種方案中，方案Ⅲ（HiTrap SP HP 5ml + HiTrap Q HP 5ml）純化效果最好，在85kDa處有蛋白條帶，分子量大小與陽參蛋白（同上）一致，灰度分析顯示目的蛋白純度為30%。圖12 兩步法HiTrap SP HP柱層析純化gBt蛋白的SDS–PAGE和 Western blotting分析M：標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白marker CCS：細(xì)胞培養(yǎng)上清Load：更換緩沖液后的細(xì)胞培養(yǎng)上清 FT：穿透液 NaCl：以不同梯度濃度NaCl洗脫的洗脫組分P：陽參蛋白 圖13 HiTrap SP HP+HiTrap Phenyl FF柱層析純化gBt蛋白的SDS–PAGE和 Western blotting分析M：標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白markerLoad：更換緩沖液后的細(xì)胞培養(yǎng)上清FT：穿透液 Fractions：方案Ⅰ（HiTrap Phenyl FF）洗脫組分P：陽參蛋白圖14 HiTrap SP HP+ Lentil lectin Sepharose 4B柱層析純化gBt蛋白的SDS–PAGE和 Western blotting分析M：標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白markerLoad：更換緩沖液后的細(xì)胞培養(yǎng)上清FT：穿透液 Fractions：方案Ⅱ（Lentil lectin Sepharose 4B）洗脫組分P：陽參蛋白圖15 HiTrap SP HP+ HiTrap Q HP柱層析純化gBt蛋白的SDS–PAGE和 Western blotting分析M：標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白marker1：方案Ⅲ（HiTrap Q HP）洗脫組分P：陽參蛋白五、重組蛋白含量測定Braford分光光度法測定蛋白含量，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖12）。將三種方法純化獲得的目的蛋白溶液，各取10μL原液，加入考馬斯亮藍(lán)G250溶液990μL，充分混勻，放置2min后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線0號管做參比，在595nm波長下比色，記錄吸光值，代入圖16方程y=+（ug），除以樣品稀釋總體積（10μL），乘以樣品稀釋倍數(shù)（1倍）即為檢測蛋白的濃度（表2），并可根據(jù)濃度計(jì)算出分別收集的1000 mL細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清或10%血清）中獲得的蛋白總量（表2）。灰度分析顯示，采用Ni Sepharose 6 FF法純化gBt蛋白獲得較高的純化效率，純度達(dá)95%，蛋白濃度為108 ug/mL，其他純化方法獲得目的蛋白的得率較低。 圖16 Bradfod法測定重組gBt蛋白含量表2：Braford分光光度法測定純化的重組蛋白含量純化方法測定值Ni Sepharose 6 FF（無血清培養(yǎng)）HiTrap SP HP（無血清培養(yǎng)）HiTrap SP HP +HiTrap Q HP（10%血清培養(yǎng)）~吸光值蛋白濃度（ug/mL）108122137252蛋白溶液量（ml）122030蛋白總量（mg）蛋白純度(%)95301530分析與討論表達(dá)體系是基因工程研究開發(fā)的基礎(chǔ)，目前用于制備基因工程藥物的表達(dá)系統(tǒng)包括原核和真核表達(dá)系統(tǒng)，國內(nèi)在HSV亞單位疫苗研究方面多采用大腸桿菌或酵母表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，它具有表達(dá)水平高、操作簡單、周期短、易于大規(guī)模高密度培養(yǎng)、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但對于全抗體和糖蛋白類生物藥物來說，表達(dá)產(chǎn)物多肽鏈的折疊、二硫鍵的形成、糖基化的有無以及糖基化的類型常常影響表達(dá)產(chǎn)物的合成分泌、生物活性、體內(nèi)穩(wěn)定性以及免疫原性等特性[61]。由于原核細(xì)胞缺少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等可用于進(jìn)行糖基化的結(jié)構(gòu)和機(jī)制，所表達(dá)的產(chǎn)物是非糖基化的，且常常以包涵體的形式存在；酵母、昆蟲及植物等真核細(xì)胞雖能進(jìn)行糖基化，但其糖基化的方式與人類等哺乳動(dòng)物細(xì)胞糖基化的方式是不一樣的。與其它真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相比，目的基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的蛋白與天然蛋白的結(jié)構(gòu)、糖基化類型和方式幾乎相同且能正確組裝成多亞基蛋白[62]。常用的幾種用于表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞株有CHO細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞株、COS細(xì)胞、293細(xì)胞等。在真核表達(dá)系統(tǒng)中，CHO 細(xì)胞是目前重組糖基蛋白生產(chǎn)的首選體系。常用的CHO細(xì)胞系有兩種：CHO和二氫葉酸還原酶雙倍體基因缺失型突變株CHO(DHFR)。與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，CHO細(xì)胞具有如下優(yōu)點(diǎn)：①具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達(dá)的糖基化藥物蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然蛋白分子；②具有產(chǎn)物胞外分泌功能，便于下游產(chǎn)物分離純化；③具有重組基因的高效擴(kuò)增和表達(dá)能力；④具有貼壁生長特性，且有較高的耐受剪切力和滲透壓能力，可以進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，表達(dá)水平較高；⑤CHO 細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞 (fibroblast)，很少分泌自身的內(nèi)源蛋白，利于外源蛋白的啟分離；/⑥能以懸浮培養(yǎng)方式或在無血清培養(yǎng)基中達(dá)到高密度培養(yǎng)。且培養(yǎng)體積能達(dá)到1000L以上[63]。 因此，CHO細(xì)胞株成為表達(dá)重組蛋白HSV I gB的理想宿主。根據(jù)目的蛋白表達(dá)的時(shí)空差異，可將表達(dá)系統(tǒng)分為瞬時(shí)、穩(wěn)定和誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。瞬時(shí)表達(dá)是指宿主細(xì)胞在導(dǎo)入表達(dá)載體后，不經(jīng)選擇培養(yǎng)，載體DNA隨細(xì)胞分裂二逐漸消失，目的蛋白表達(dá)時(shí)期短暫。穩(wěn)定表達(dá)指載體進(jìn)入宿主細(xì)胞并經(jīng)選擇培養(yǎng)，載體DNA穩(wěn)定存在于細(xì)胞內(nèi)，目的蛋白的表達(dá)持久而穩(wěn)定[64]。本研究選擇穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)，以保證重組蛋白長期、穩(wěn)定的表達(dá)。轉(zhuǎn)染，是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專門技術(shù)。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉(zhuǎn)染目前已成為實(shí)驗(yàn)室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途徑。物理方法有電穿孔、顯微注射和基因槍，如電穿孔法：利用特殊實(shí)驗(yàn)裝置產(chǎn)生高壓電，使細(xì)胞膜上瞬間穿開小孔，胞外溶液中的質(zhì)粒DNA隨之進(jìn)入胞漿。此法轉(zhuǎn)染效率很高，但需要特殊設(shè)備?；瘜W(xué)介導(dǎo)方法很多，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法[6566]和多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù)。生物介導(dǎo)方法，有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染，和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)。理想細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，是目前轉(zhuǎn)染效率最高的方法，同時(shí)具有細(xì)胞毒性很低的優(yōu)勢。但是，病毒轉(zhuǎn)染方法的準(zhǔn)備程序復(fù)雜，常常對細(xì)胞類型有很強(qiáng)的選擇性。本研究采用的脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法，利用脂質(zhì)體既親水又親油的特點(diǎn)，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒HSV I gBt pMCE5包裹在脂質(zhì)體中，形成脂質(zhì)體DNA復(fù)合物，通過內(nèi)吞方式進(jìn)入細(xì)胞，有利于使目的基因轉(zhuǎn)入。脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法適用性廣，重復(fù)性好，作用溫和，操作簡便。尤其是新一代產(chǎn)品Lipofectamine TM2000 ，轉(zhuǎn)染效率很高，是目前常用的一種基因轉(zhuǎn)移方法。通過Western blotting檢測轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的CHO細(xì)胞表達(dá)上清，發(fā)現(xiàn)在重組gBt蛋白在分子量85 kDa處出現(xiàn)蛋白條帶，與預(yù)期大小相符，無其他雜帶出現(xiàn)，說明糖基化較均一，表達(dá)產(chǎn)物以可溶性形式存在于細(xì)胞上清中。本研究設(shè)計(jì)的重組糖蛋白片段，均去除了其天然的信號肽序列，取而代之的是優(yōu)化的人免疫球蛋白IgG κ輕鏈可變區(qū)信號肽序列。早在1972年Milstein等發(fā)現(xiàn)在人類當(dāng)中成熟的IgG免疫球蛋白輕鏈要比IgG輕鏈的前體在N端少20個(gè)氨基酸。他們推測這20個(gè)氨基酸可能和其通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)而分泌有關(guān)。美國Bloble實(shí)驗(yàn)室證實(shí)了以上推測，并在以上實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上Bloble和Dobberstin提出了信號肽假設(shè)。優(yōu)化的信號肽序列與IgG κ輕鏈可變區(qū)（Genbank登錄號：X72456）前57個(gè)堿基完全一致，以非極性氨基酸為主，夾雜一些極性中性氨基酸，比原信號肽序列非極性氨基酸更加密集，形成的疏水性肽鏈更容易被細(xì)胞分泌出細(xì)胞膜。CHO表達(dá)亞單位疫苗有諸多優(yōu)勢，但用含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO細(xì)胞成本高，在一定程度上限制了CHO細(xì)胞表達(dá)亞單位疫苗的發(fā)展。含血清的培養(yǎng)基生產(chǎn)的蛋白制品有許多不利，如增加培養(yǎng)成本、污染機(jī)會(huì)、純化難度，以及增加產(chǎn)品質(zhì)控指標(biāo)等。因此，為降低生產(chǎn)成本和減少血清制品帶來的潛在危害性，本實(shí)驗(yàn)嘗試使用無血清培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基（Serum Free Midium），即不需添加血清就可維持細(xì)胞在體外較長時(shí)間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。廣義上，無血清培養(yǎng)基分三種：無血清培養(yǎng)基 (Serum free，SFM) ，無需添加血清，但可能含有少量或者大量蛋白；無蛋白培養(yǎng)基（Protein Free Midium，PFM），血清和蛋白質(zhì)（尤其動(dòng)物蛋白）都沒有，可能會(huì)有些短肽；限定化學(xué)成分培養(yǎng)基（chemical defined Midium，CDM），培養(yǎng)基中的素有成分都是純化學(xué)合成的，成分完全已知。CDM不含有動(dòng)物蛋白，沒有添加植物水解物，而是使用了一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等，這種培養(yǎng)基更有利于分析細(xì)胞的分泌產(chǎn)物。從生物技術(shù)發(fā)展的趨勢來看，不含動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基有廣泛的應(yīng)用前景，許多利用基因工程技術(shù)重組的蛋白質(zhì)最終要應(yīng)用于人體，如果再生長過程中使用了含有動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，純化過程就比較復(fù)雜，最終要達(dá)到一定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也有一定的難度[67]。本實(shí)驗(yàn)比較了GIBCO公司開發(fā)的四種無血清培養(yǎng)基對CHO細(xì)胞表達(dá)重組蛋白的影響。Ham’s F12與DMEM 等體積混合使用，得到一種高濃度與成分多樣化相結(jié)合的培養(yǎng)基；FreeStyle CHO Expression Medium、CD CHO Medium、CD OptiCHO Medium是CDM，專用于CHO細(xì)胞表達(dá)分泌外源蛋白，均為非動(dòng)物源性產(chǎn)品，用有生物活性的合成化學(xué)物代替天然的動(dòng)物源性物質(zhì)，所有組分均有明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)。使CDM除節(jié)約成本外，還具有以下優(yōu)點(diǎn)：①完全采用人工合成的化合物，成分確定，可以排除血清中未知成分干擾，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為可靠；②采用無血清培養(yǎng)基更容易發(fā)現(xiàn)一些在血清培養(yǎng)基中不容易發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子；③無動(dòng)物來源，無支原體，無病毒污染，降低外來物質(zhì)污染的風(fēng)險(xiǎn)；④簡化純化和下游處理過程，節(jié)省時(shí)間；⑤無批間差異，避免品質(zhì)波動(dòng)。本部分實(shí)驗(yàn)建立了穩(wěn)定表達(dá)HSV I gB的CHO細(xì)胞株。為大量獲得重組蛋白比較了GIBCO公司開發(fā)的四種無血清培養(yǎng)基DEME/F12 Medium、FreeStyle CHO Expression Medium、CD CHO Medium、CD OptiCHO Medium培養(yǎng)下，CHO細(xì)胞表達(dá)重組蛋白的差異，優(yōu)化表達(dá)方案，確定最優(yōu)培養(yǎng)基及收集細(xì)胞上清的最佳時(shí)間，保證細(xì)胞穩(wěn)定、高效表達(dá)。將不含血