【正文】 穩(wěn)定高表達(dá)HSV I糖蛋白B細(xì)胞株的建立及表達(dá)蛋白的免疫特性畢業(yè)論文目 錄中文摘要……………………………………………………………………………1英文摘要……………………………………………………………………………3前言…………………………………………………………………………………6技術(shù)路線……………………………………………………………………………11正文…………………………………………………………………………………12第一部分………………………………………………………………………12材料與方法………………………………………………………………12結(jié)果………………………………………………………………………19分析與討論………………………………………………………………23第二部分………………………………………………………………………26材料與方法………………………………………………………………26結(jié)果………………………………………………………………………34分析與討論………………………………………………………………46第三部分………………………………………………………………………50材料與方法………………………………………………………………50結(jié)果………………………………………………………………………52分析與討論………………………………………………………………54小結(jié)……………………………………………………………………………56參考文獻(xiàn)……………………………………………………………………………57文獻(xiàn)綜述……………………………………………………………………………64攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況等……………………………………………………78致謝………………………………………………………………………………79南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文前 言單純皰疹病毒 (Herpes simplex virus，HSV) 是人類病毒感染性疾病中最常見的病原體之一。HSV為有包膜的DNA 病毒，屬皰疹病毒科α亞科，由外膜、核衣殼、皮質(zhì)層和核酸組成。外膜為雙層類脂質(zhì)，膜上有糖蛋白短突起。內(nèi)有核心，核心由核衣殼蛋白包裹，為20面體，有162殼粒。病毒體直徑為120～150nm[1]。其基因組為一線性雙鏈DNA分子，由共價連接的長片段 (L) 和短片段 (S) 組成，兩者分別占病毒DNA的 82 % 和18 % ，每一片段由中間的獨特序列 (U) 和兩端的倒置重復(fù)序列組成，根據(jù)L和S片段相互連接方式的不同可有4 種同分異構(gòu)體[24]。HSV有二個血清型，即HSV I型和HSV II型，迄今為止已測定了HSV I和HSV II基因組的全部序列，序列分析顯示二者在核苷酸序列、框架結(jié)構(gòu)、編碼蛋白質(zhì)功能上存在較大同源性，型間有共同抗原，也有特異性抗原。HSV I感染主要引起口唇部皰疹、皰疹性眼角膜炎、皰疹性腦炎等疾病。HSV II感染主要引起皰疹性陰道炎、新生兒皰疹性腦炎、生殖器皰疹，并且與女性宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，也是HIV性傳播的重要協(xié)同輔助因素之一[5]。同時，HSV I引起的生殖性皰疹也日益增多。在免疫正常者中HSV感染很少導(dǎo)致嚴(yán)重疾病，但在免疫缺陷者中卻可導(dǎo)致嚴(yán)重疾病或并發(fā)癥，在孕婦中可引起宮內(nèi)感染和新生兒皰疹而嚴(yán)重影響優(yōu)生優(yōu)育。母體在感染HSV II后可通過產(chǎn)道或密切接觸， 垂直傳染子代新生兒引起皰疹病毒腦炎，死亡率高達(dá)100%[6]。HSV先在感染的組織或接近部位繁殖，構(gòu)成原發(fā)性感染灶，原發(fā)感染產(chǎn)生免疫力后，將大部分病毒清除，部分病毒可沿神經(jīng)髓鞘到達(dá)三叉神經(jīng)節(jié)（HSV I）和脊神經(jīng)節(jié)（HSV II）細(xì)胞中或周圍星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，以潛伏狀態(tài)持續(xù)存在，與機(jī)體處于相對平衡，不引起臨床癥狀，即潛伏感染。當(dāng)受到外界刺激如物理、情感壓力、發(fā)熱、紫外線照射、組織損傷或免疫抑制等，潛伏的病毒激活增殖，沿神經(jīng)纖維索下行至感覺神經(jīng)末梢，至附近表皮細(xì)胞內(nèi)繼續(xù)增殖，引起復(fù)發(fā)感染[79]。其特點是每次復(fù)發(fā)病變往往發(fā)生于同一部位。最常見在唇鼻間皮膚與粘膜交界處出現(xiàn)成群的小皰疹。皰疹性角膜炎、皰疹性宮頸炎等亦可反復(fù)發(fā)作[10]。HSV的感染在全世界都非常普遍。HSV I是世界上流行最廣的病毒性感染之一，成年人血清中陽性率高達(dá)85%以上，某些國家和地區(qū)甚至達(dá)到100%；HSV II是目前世界上發(fā)生最廣的性傳播疾病，據(jù)估計全世界有20%人為HSV II陽性，并且發(fā)病人數(shù)以約25%的比例逐年增加[1113]。一項數(shù)據(jù)顯示，近年來我國的HSV I感染顯著增多，約占HSV感染總?cè)藬?shù)的10%~40%。HSV II的感染率在患有性病、%，%。在美國總?cè)丝谥?，?0年HSV II血清流行率增加了1/3，達(dá)23%[14]。據(jù)WHO 估計，每年生殖器皰疹的新發(fā)病例約2 000萬。HSV感染后僅有10%~20%的患者有癥狀[13,15]，而臨床上80% HSV感染者表現(xiàn)為無癥狀感染或癥狀未被識別，沒有癥狀的患者其體內(nèi)的病毒仍然處于激活狀態(tài)，因此70%以上的HSV傳播是由無癥狀的患者導(dǎo)致的，這也是HSV傳播逐年增加并難以控制的原因[1617]。盡管現(xiàn)有的抗病毒藥物應(yīng)用能縮短病毒感染的病程，促進(jìn)皮損愈合、縮短排毒時間、減輕傳染性，防止并發(fā)癥，并且對治療復(fù)發(fā)性感染取得一些效果，但這些抗病毒藥物不能有效預(yù)防皰疹病毒原發(fā)感染及完全控制皰疹病毒潛伏感染和復(fù)發(fā)性感染[1820]。不少研究證實，阿昔洛韋、伐昔洛韋和泛昔洛韋抑制治療法可顯著減少生殖器皰疹的有癥狀復(fù)發(fā)和無癥狀排毒，但臨床上使用這些抗病毒藥物治療HSV感染時，常出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象而影響療效[21]。因此，研制和接種HSV疫苗是預(yù)防該病毒感染的理想方法。HSV疫苗按其形成和特點可分為：滅活的全病毒疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗、活載體基因工程疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗等[22]。滅活的全病毒疫苗是通過加熱、紫外輻射等物理、化學(xué)方法將接種在雞胚或細(xì)胞中的HSV病毒滅活并經(jīng)過一系列純化制備成的。滅活疫苗既可用于預(yù)防HSV感染，也可用于治療HSV感染。但滅活疫苗存在免疫原性弱、不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生廣泛持久的免疫反應(yīng)、不能確定是否所有病毒均被滅活、裂解的DNA片段潛在致癌的可能性、生產(chǎn)費用高等缺點[23] ，并且有潛在致癌性等問題[24]。減毒活疫苗是指由活病毒不斷在細(xì)胞中培養(yǎng)繁殖、傳代，直到得到毒力很弱的病毒株。這類疫苗免疫力強(qiáng)、作用時間長，但安全性是一個問題。一方面，毒株的弱毒力不穩(wěn)定，可能返祖；另一方面，病毒會潛伏在宿主體內(nèi)，如果宿主機(jī)體抵抗力下降，弱毒株也將對機(jī)體造成損害，而且，對女性來說，還有潛在致癌的可能性。近年來HSV減毒活疫苗的研究主要集中在特異性地缺失病毒某一基因，使其神經(jīng)毒性減弱，降低其建立潛伏感染的能力等，同時保持病毒的增殖能力和免疫原性這一目標(biāo)上。Post和Roizman等以HSV I的F株為原型構(gòu)建的HSV減毒活疫苗就是通過刪減決定皰疹病毒毒性的基因片段來制備的，構(gòu)建的這種重組病毒能有效地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答[2526]。FHo J 用包含HSV II gD全長基因以及刪除部分基因的質(zhì)粒作疫苗來免疫小鼠。發(fā)現(xiàn)含全長基因片段的質(zhì)粒能引起強(qiáng)的細(xì)胞免疫，但僅能引起較低的抗體水平；含部分基因片段的質(zhì)粒能引起高效價的抗體水平，但只有很弱的細(xì)胞免疫[27]。亞單位疫苗是通過提取或體外合成病毒分泌的蛋白及包膜表面的結(jié)構(gòu)蛋白而制成的一種疫苗，它可以有效避免利用全病原體生產(chǎn)疫苗所導(dǎo)致的生物安全風(fēng)險，并有利于提高疫苗中有效成分的濃度、純度，以及開發(fā)多價多聯(lián)疫苗[28]。與傳統(tǒng)滅活疫苗及減毒活疫苗相比，亞單位疫苗具有安全性好、易于生產(chǎn)、可反復(fù)使用而不會誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生載體抗體等特點。許多研究采用HSV包膜糖蛋白作為免疫原來制備亞單位疫苗。目前已發(fā)現(xiàn)并正式命名的HSV包膜糖蛋白共有12種，它們以獨特或復(fù)合體的形式在HSV復(fù)制循環(huán)及病毒的感染致病中發(fā)揮不同作用[29]。其中以gD和gB尤為重要，它們是HSV主要的免疫原，能誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫，產(chǎn)生高滴度中和抗體，激發(fā)DTH 反應(yīng)及T細(xì)胞增殖反應(yīng)，以gD免疫作用最強(qiáng)[30]。大量動物實驗表明，亞單位疫苗在保護(hù)機(jī)體抵抗HSV原發(fā)感染和復(fù)發(fā)感染中顯示了良好的安全性和有效性。在臨床試驗中，由Chiron公司研發(fā)的gB2/gD2聯(lián)合疫苗配伍MF59佐劑在人類中具有高度的免疫原性，但在III期臨床試驗中卻未能保護(hù)受試者抵抗HSV II的感染[3132]。另一種由Glaxo Smith Kline公司開發(fā)的gD2聯(lián)合佐劑AS04，在兩個III期的臨床試驗中能對HSV血清陰性的婦女提供有效的保護(hù)（有效率分別為73%和74%），而對血清反應(yīng)陽性的婦女則效果有限（有效率分別為46%和39%）[33]。非致病性的活載體基因工程疫苗是指將非致病性微生物通過基因工程的方法使之?dāng)y帶并表達(dá)某種特定病原物的抗原決定簇基因，產(chǎn)生免疫原性；或是將致病性微生物通過基因工程的方法修飾或去掉毒性基因以后，仍保持免疫原性王[3435]?；钶d體疫苗兼有減毒活疫苗和亞單位疫苗的優(yōu)點，在免疫效力上很有優(yōu)勢。目前研究較多的是腺病毒載體，其獨特優(yōu)勢在于基因組內(nèi)有2個能插入外源基因的功能區(qū)域，有研究指出表達(dá)HSV gB的重組腺病毒能引起較好的體液免疫應(yīng)答，在自然呼吸道感染的情況下能產(chǎn)生好的粘膜免疫應(yīng)答[34]。核酸疫苗是用包含病毒基因的DNA質(zhì)粒接種體內(nèi)，在體內(nèi)表達(dá)相應(yīng)病毒蛋白從而誘導(dǎo)免疫反應(yīng)[3637]。其優(yōu)點在于能克服由非復(fù)制性抗原所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫效果較低等難題，因而，即使沒有有效的佐劑，這種疫苗也能誘導(dǎo)強(qiáng)的細(xì)胞免疫。其他疫苗方面研究包括T細(xì)胞表位多肽疫苗[38]，增強(qiáng)先天免疫反應(yīng)策略[39]，增強(qiáng)免疫反應(yīng)新的傳遞系統(tǒng)[40]等。國內(nèi)對HSV疫苗的研究主要集中在核酸疫苗的探索。廣州軍區(qū)總院[4142]，汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院等單位的初步研究結(jié)果顯示HSV II核酸疫苗可刺激小鼠產(chǎn)生保護(hù)性抗體，但在人體中的安全性問題尚難確定。病毒糖蛋白 (glycoproteins, gp) 是病毒毒粒表面的抗原決定簇，是有包膜病毒表面脂質(zhì)雙層膜的重要成分，其功能關(guān)系到病毒的吸附、進(jìn)入和融合以及抗原性。病毒外膜突起的糖蛋白與易感細(xì)胞受體接觸，相互作用，使病毒吸附于細(xì)胞表面經(jīng)細(xì)胞融合或胞飲進(jìn)入細(xì)胞。并且病毒糖蛋白與病毒的致病作用以及誘導(dǎo)宿主的免疫反應(yīng)等密切相關(guān)[43]。Ghiasi 等利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出8種HSV I糖蛋白，比較了它們的免疫原性和保護(hù)作用。小鼠分別接種gB和gD疫苗在體內(nèi)產(chǎn)生高滴度的中和HSV I抗體，并且非常有效地預(yù)防病毒建立潛伏感染，沒有發(fā)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)；小鼠分別接種gC、gE、gI和gH/gL疫苗在體內(nèi)產(chǎn)生中等滴度的中和HSV I抗體，并且有效地預(yù)防病毒建立潛伏感染，發(fā)生強(qiáng)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)[44]。目前亞單位疫苗研究的熱點在HSV的gB和gD，研究人員利用DNA 重組技術(shù)，在大腸桿菌、酵母、桿狀病毒、哺乳動物細(xì)胞等多種表達(dá)系統(tǒng)中分別或聯(lián)合表達(dá)這兩種糖蛋白，制成亞單位疫苗，動物實驗證實，它們均能不同程度地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體，抗體產(chǎn)生水平高低與動物遭受病毒感染的程度成正比，還可不同程度地降低動物被病毒感染后的發(fā)病率和死亡率[4546]。gB由基因UL27編碼，包括696個氨基酸的胞外功能區(qū)，69個氨基酸的跨膜區(qū)和109個氨基酸的胞內(nèi)區(qū)。它是皰疹病毒家族中高度保守的蛋白，各毒株間差異較小，且與所有的皰疹類病毒亞群有較大的同源性[47]。gB是在感染細(xì)胞中含量最多的蛋白，是感染宿主細(xì)胞免疫和體液免疫的主要靶標(biāo)，也是HSV特定細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)主要靶標(biāo)，CTL對單皰病毒從原發(fā)感染治愈到預(yù)防潛伏感染的建立起重要作用。小鼠接種重組gB蛋白在體內(nèi)產(chǎn)生中和HSV I抗體，對不同毒株在腹膜內(nèi)或腳蹼接種病毒的免疫試驗具有完全保護(hù)作用，與接種減毒活疫苗保護(hù)作用相似，保護(hù)不被大劑量病毒致死，并且抑制潛伏感染和復(fù)發(fā)感染的建立，gB保護(hù)作用具有長效免疫活性而不是短效作用，明顯保護(hù)三叉神經(jīng)節(jié)免于感染。也有實驗表明兔接種分泌形式的gB，對由HSV I感染引起的角膜炎，腦膜炎和死亡具有明顯保護(hù)作用[48]。研究表明：為增強(qiáng)編碼抗原蛋白的免疫原性，可去除其部分功能性編碼序列，特別在完整抗原蛋白對宿主具有毒性或免疫抑制作用的情況下，對抗原蛋白進(jìn)行截短表達(dá)就尤為重要。而截短后的基因構(gòu)建的疫苗，與用完整基因構(gòu)建的疫苗對HSV病毒攻擊具有相同的保護(hù)作用[4950]。基于gB攜帶抗原決定簇的數(shù)量、在HSV I感染及誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)中的重要作用，本研究選取HSV I gB作為HSV基因重組亞單位疫苗的候選疫苗。通過對HSV I Patton株gB氨基酸序列分析，篩選含強(qiáng)抗原決定簇較聚集的胞外區(qū)片段，優(yōu)化基因序列，化學(xué)合成全新的基因片段gBt，克隆至真核細(xì)胞表達(dá)載體，建立重組gBt蛋白哺乳動物細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，并優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)方案。獲得的高表達(dá)重組蛋白經(jīng)純化、鑒定后，免疫小鼠制備抗血清，并對其抗原性和免疫活性進(jìn)行檢測。技術(shù)路線優(yōu)化合成HSV I gBt基因序列, 以pMCE5作為真核表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒gBtpMCE5。將成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒gBtpMCE5，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，Western blotting鑒定表達(dá)的重組gBt蛋白，多次連續(xù)克隆化，Dot blotting法篩選穩(wěn)定高效表達(dá)的單克隆細(xì)胞株；優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)、表達(dá)方案，收集細(xì)胞表達(dá)上清。細(xì)胞上清的純化與鑒定，獲得高純度重組gBt蛋白。直接ELISA法檢測純化后重組gBt蛋白的抗原性； 以重組蛋白免疫小鼠制備多抗血清，間接ELISA法檢測效價，評價其體液免疫效果。第一部分HSV I gB抗原表位分析、基因優(yōu)化及真核表達(dá)載體的構(gòu)建抗原表位又叫抗原決定簇，是蛋白質(zhì)抗原性的基礎(chǔ)，負(fù)責(zé)與抗體分子或免疫細(xì)胞表面的抗原受體結(jié)合。同時，蛋白的表達(dá)水平受多種因素和過程的影響，基因水平的優(yōu)化對蛋白質(zhì)的高表達(dá)至關(guān)重要。因此，蛋白質(zhì)抗原表位分析和基因優(yōu)化設(shè)計的原則是研制亞單位疫苗的重要線索和依據(jù)。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)分析工具對HSV I gB抗原表位進(jìn)行分析，篩選出抗原表位較富集的胞外區(qū)片段；優(yōu)化基因序列，選用真核細(xì)胞偏愛的密碼子，重新設(shè)計合成基因gBt，并克隆至pMCE5載體中，構(gòu)建適