zhou目的蛋白質(zhì)表達、純化、檢測(1)(已修改)
2025-05-19 12:14 本頁面
【正文】 實驗五 目的基因的原核表達及檢測 現(xiàn)代分子生物學(xué)大實驗 實驗?zāi)康? ? 重點掌握 表達載體構(gòu)建 的原理及方法 ? 掌握目的基因原核 誘導(dǎo)表達 的原理及方法 ? 了解目的蛋白質(zhì) “ 標簽 ” 純化 的基本原理和方法 ? 掌握 PAGE變性凝膠電泳 的原理及方法 ? 掌握 考馬斯亮藍染色 的方法 實驗原理 ? 目的蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達 ? 目的蛋白質(zhì)的純化 ? 目的蛋白質(zhì)的檢測 實驗原理 ? 蛋白質(zhì)的表達：將 克隆基因 插入 合適載體 后導(dǎo)入 宿主細胞 表達大量蛋白質(zhì)的方法。 ? 體內(nèi)很難分析單個蛋白質(zhì)的作用 ? 進行大量表達和純化是為了在體外進行研究 ? 應(yīng)用于蛋白純化、定位及功能分析等方面 實驗原理 圖 pET14bHisTATEGFPp3816 peptides 融合蛋白 在 Hela細胞中的熒光顯微鏡檢測（ 400） 例 ? 酵母表達系統(tǒng) 昆蟲表達系統(tǒng) 哺乳動物細胞表達系統(tǒng) ? 表達的蛋白具有正常的活性、構(gòu)象 ? 技術(shù)難度較大、耗時、耗資 ? 大腸桿菌表達系統(tǒng) ? 實驗技術(shù)簡單，時間較短，費用低，系統(tǒng)比較完備 ? 不能有效地對重組蛋白質(zhì)進行修飾加工，易形成包涵體 原核細胞表達系統(tǒng) 真核細胞表達系統(tǒng) 實驗原理 ? 原核細胞表達系統(tǒng)菌株 – 菌株內(nèi)源的蛋白酶過多，可能會造成外源表達產(chǎn)物的不穩(wěn)定，所以一些 蛋白酶缺陷型菌株 往往成為理想的起始表達菌株。 – 堪稱經(jīng)典的 BL21系列就是 lon和 ompT蛋白酶缺陷型，也是我們非常熟悉的表達菌株。 – 大名鼎鼎的 BL21(DE3)融源菌則是添加 T7聚合酶基因，為 T7表達系統(tǒng)而設(shè)計。 實驗原理 ? 原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建 – 目的基因 – 表達載體 Plasmid Tag lacIq Promoter Ampr 多克隆位點 實驗原理 ? 目的基因 / DNA / PCR / 酶切 / Primer ? 例： ? p38中抑制多肽 16肽序列 – GGA AGA ACA TTG TTT CCT GGT ACA GAC CAT ATT GAT CAG TTG AAG CTC ? F 5’ACG GAT CC TA GGA AGA ACA TTG TTT CCT GGT3’ ? R 5’ACG GAT CC TTA GAG CTT CAA CTG ATC AAT ATG G3’ ? 5’端引物中 AC是隨機保護堿基， G GAT CC
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