【正文】 研究基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及其調(diào)控來(lái)探索雄性不育的機(jī)理。抑制性差減雜交(SSH)技術(shù)及其在大白菜轉(zhuǎn)育上的應(yīng)用。白菜原產(chǎn)于我國(guó)北方，俗稱大白菜。引種南方，南北各地均有栽培。十九世紀(jì)傳入日本、歐美各國(guó)。白菜是人們生活中不可缺少的一種重要蔬菜，為廣大群眾所喜愛(ài)[1]。抑制性差減雜交技術(shù)(SSH)是基于抑制PCR 作用的cDNA 差減雜交，是在轉(zhuǎn)錄水平上研究差異基因表達(dá)的技術(shù)。該技術(shù)在一個(gè)循環(huán)過(guò)程中完成差異表達(dá)基因豐度的均等化及目標(biāo)群體和對(duì)照群體中相同基因的去除，從而實(shí)現(xiàn)差異表達(dá)基因的高度富集。一個(gè)典型的SSH 過(guò)程，可在一個(gè)差減雜交過(guò)程中將稀有基因序列富集上千倍。本文通過(guò)詳細(xì)分析該技術(shù)在植物差異表達(dá)基因分離中的應(yīng)用發(fā)現(xiàn)：SSH 技術(shù)主要用于分離組織特異性表達(dá)和誘導(dǎo)型表達(dá)的基因。首先，SSH 技術(shù)廣泛應(yīng)用在分離植物發(fā)育過(guò)程中不同發(fā)育階段和不同組織器官中的組織特異性表達(dá)的基因，為揭示植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的分子機(jī)理提供了有效手段；另外，在不同植物中，該技術(shù)被大量應(yīng)用于分離各種生物及非生物脅迫條件下誘導(dǎo)表達(dá)的抗性相關(guān)基因，可以揭示植物抗逆的分子機(jī)理。目前，SSH 技術(shù)已開(kāi)始應(yīng)用于分離與次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因。SSH 技術(shù)是分離植物差異表達(dá)基因，揭示植物復(fù)雜生命現(xiàn)象分子機(jī)理的有效方法，將在植物差異表達(dá)基因研究中得到更廣泛的應(yīng)用[2]。上世紀(jì)90年代以來(lái),隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展以及多物種包括人類的基因組全序列測(cè)定計(jì)劃的陸續(xù)完成,分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)已經(jīng)從結(jié)構(gòu)基因組研究轉(zhuǎn)向基因功能和表達(dá)調(diào)控的功能基因組研究,于是多種用于差異表達(dá)分析的基因克隆技術(shù)相繼問(wèn)世。這些技術(shù)不依賴于已知基因的位置和功能,可以直接在基因組中從DNA和RNA水平獲得有意義的目的基因片段。其中包括差異篩選、消減雜交和mRNA差異顯示法,以及代表性差異分析法、抑制性消減雜交和交互消減RNA 差別顯示法( reciprocal subtraction differential display, RSDD)等。抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)是一種比較、分離不同細(xì)胞系、不同組織間或同一細(xì)胞系、同一組織在不同條件下差異表達(dá)基因的方法。與其他技術(shù)相比，SSH技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、周期短等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái),無(wú)論在技術(shù)改良上還是在應(yīng)用研究中,抑制性消減雜交技術(shù)都取得了一些新進(jìn)展[3]。抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)是以抑制性PCR(suppression PCR)為基礎(chǔ),將均等化檢測(cè)子cDNA單鏈步驟和消減雜交步驟合為一體的技術(shù)。簡(jiǎn)言之, SSH技術(shù)的原理可概括為“消同富異”,即消減同源序列,富集差異序列。抑制性PCR是利用DNA鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火且更穩(wěn)定的動(dòng)力學(xué)特性,使非目標(biāo)序列片段兩端的長(zhǎng)反向重復(fù)序列在退火時(shí)產(chǎn)生“鍋柄樣”結(jié)構(gòu)(panlike structure) ,無(wú)法與引物配對(duì),從而選擇性地抑制了非目標(biāo)基因片段的擴(kuò)增。同時(shí),該方法應(yīng)用了雜交的二級(jí)動(dòng)力學(xué)原理,即豐度高的單鏈cDNA在退火時(shí)產(chǎn)生同源雜交的速度要快于豐度低的單鏈cDNA,從而使在雜交完畢后原來(lái)在豐度上有差異的單鏈cDNA達(dá)到均等化的目的。因此,SSH技術(shù)是抑制性PCR與消減雜交技術(shù)相結(jié)合的更簡(jiǎn)單、更快速的分離差異表達(dá)基因的方法[4]。抑制差減雜交(SSH)技術(shù)的主要步驟有: (1)cDNA的合成與酶；(2)試驗(yàn)組cDNA分成兩份,并與兩個(gè)不同的接頭連接；(3)試驗(yàn)組的cDNA與過(guò)量的驅(qū)動(dòng)組cDNA 雜交；(4)選擇性PCR 擴(kuò)增與接頭相連的試驗(yàn)組cDNA 分子；(5)克隆PCR 產(chǎn)物,構(gòu)建差減文庫(kù)；(6) 篩選文庫(kù)[5]。SSH技術(shù)在植物上的應(yīng)用主要包括兩個(gè)方面:一方面涉及植物的生長(zhǎng)發(fā)育及組織特異性研究,即用于分離植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不同發(fā)育階段和不同組織器官中的特異性表達(dá)的基因,這為揭示植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的分子機(jī)制提供了有效手段。另一方面,在植物抵抗各種脅迫, 包括生物 和非生物因素的研究領(lǐng)域中,這項(xiàng)技術(shù)也已成為研究基因差異表達(dá)的重要工具,有助于揭示植物抗逆的分子機(jī)制。目前, SSH技術(shù)已開(kāi)始應(yīng)用于研究共生菌與植物間的相互作用、分離與次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因和優(yōu)勢(shì)種質(zhì)資源的鑒定等方面[6]。 SSH技術(shù)在植物抗病性機(jī)制研究中的應(yīng)用SSH技術(shù)作為一種較為有效的分離差異表達(dá)基因的方法,已經(jīng)在植物抗病性機(jī)理研究上被廣泛應(yīng)用,并取得了一些進(jìn)展。目前多數(shù)研究都集中在差異表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建及篩選方面?？剐曰虻耐暾寺∵€不多[7]。小麥白粉病是我國(guó)小麥生產(chǎn)中的主要病害之一,了解小麥的抗白粉病機(jī)制,是進(jìn)行抗病育種的基礎(chǔ),駱蒙等(2002)利用抗白粉病品系“百農(nóng)3217M ardler”BC5F4為材料,構(gòu)建了一個(gè)白粉菌侵染初期的SSH文庫(kù),通過(guò)網(wǎng)上功能查詢共獲得功能已知EST 271條通過(guò)分析推測(cè)苯丙烷代謝途徑、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)修飾作用、細(xì)胞保衛(wèi)機(jī)制參與了小麥對(duì)白粉病的抗病過(guò)程田振東等(2003)利用SSH技術(shù)構(gòu)建了一個(gè)富集馬鈴薯晚疫病抗性相關(guān)基因的差減文庫(kù),進(jìn)一步利用反向Northern技術(shù)進(jìn)行篩選, 共獲得150個(gè)病原菌誘導(dǎo)后信號(hào)明顯增強(qiáng)的克隆。序列分析表明,部分序列的功能與抗病性明顯相關(guān)。在此基礎(chǔ)上克隆了一個(gè)晚疫病誘導(dǎo)基因POTHR 1在大豆研究方面,大豆花葉病毒是危害大豆生產(chǎn)和品質(zhì)的病害之一, 大豆抗花葉病毒表達(dá)譜的建立將會(huì)更加有效的輔助育種劉春燕等(2005)通過(guò)對(duì)所構(gòu)建的大豆花葉病毒誘導(dǎo)表達(dá)文庫(kù)的分析,獲得的EST涉及細(xì)胞自身保護(hù)、信號(hào)傳導(dǎo)、抑制病原菌生長(zhǎng)、系統(tǒng)獲得性抗性以及光合作用、呼吸作用及蛋白質(zhì)合成等過(guò)程。王力華等(2004)為了獲得陸地棉黃矮病抗性相關(guān)候選基因,利用棉花黃矮病菌大麗輪枝菌毒素粗提物誘導(dǎo)耐黃矮病品種, 對(duì)得到的180個(gè)克隆進(jìn)行反Northern雜交,篩選出15個(gè)陽(yáng)性克隆,并對(duì)這15個(gè)EST進(jìn)行了定位趙小蘭等(2005)利用SSH進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌脅迫下多花薔薇的基因表達(dá)分析, 所獲得的cDNA功能涉及細(xì)胞分裂、生長(zhǎng), 逆境防御、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及激素調(diào)節(jié)等功能。在亞馬遜河及中美洲廣泛種植的可可樹(shù),每年因?yàn)椴【那忠u可導(dǎo)致30%～40%的減產(chǎn),為了研究可可樹(shù)的抗病機(jī)制,Joseph等(2004)用植物毒素類似物侵染可可樹(shù),研究了可可樹(shù)的抗病機(jī)理, 在1256個(gè)EST中有330個(gè)EST與防御反應(yīng)有關(guān)。Hiroyuki等(2005)通過(guò)研究豌豆對(duì)枯萎病的抗性反應(yīng),分別鑒定出155個(gè)病菌誘導(dǎo)上調(diào), 34個(gè)下調(diào)基因。結(jié)果為豌豆防御枯萎病病菌的早期侵染提供了重要信息[8]。 抑制性差減雜交(SSH)技術(shù)在分離植物差異表達(dá)基因中的應(yīng)用在植物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，SSH技術(shù)特別適合于分離發(fā)育階段轉(zhuǎn)型前后，個(gè)體內(nèi)不同器官之間，以及受環(huán)境因子影響較大的差異表達(dá)基因。這些待比較的群體間存在著豐富的差異表達(dá)基因，應(yīng)用SSH技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯，一次可以克隆到多個(gè)不同豐度的差異表達(dá)基因。另外，由于SSH技術(shù)的兩次差減雜交和兩次抑制性PCR的過(guò)程，可以分離到原本表達(dá)量很低的轉(zhuǎn)錄因子(FaivreRampant et al,2004)，這些基因的獲得對(duì)于揭示植物生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)理具有重要作用[9]。植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中差別表達(dá)基因主要分為兩類：組織特異性表達(dá)的基因和誘導(dǎo)表達(dá)型基因。植物體從種子萌發(fā)，到根莖葉的生長(zhǎng)發(fā)育、開(kāi)花結(jié)果直至衰老和死亡的整個(gè)生命周期中，任何一個(gè)發(fā)育階段及相關(guān)的生命現(xiàn)象都是不同組織特異性基因表達(dá)的結(jié)果；而植物在逆境脅迫(生物及非生物脅迫)條件下產(chǎn)生的環(huán)境適應(yīng)性和抗性則多是誘導(dǎo)型基因表達(dá)的結(jié)果。目前，SSH技術(shù)在分離組織特異性表達(dá)基因和誘導(dǎo)表達(dá)型基因中均有應(yīng)用，這些差異表達(dá)基因的分離為揭示植物不同生長(zhǎng)階段的轉(zhuǎn)型、植物不同器官的生理功能、植物抗性產(chǎn)生的分子機(jī)理提供了重要的依據(jù)[10]。 1 植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中特異表達(dá)基因的分離應(yīng)用SSH技術(shù)，在植物體不同發(fā)育階段或同一植物體的不同器官分別取樣作為tester 和driver，建立抑制性差減文庫(kù)已分離到了花芽分生組織形成、花器官成熟、花粉管萌發(fā)、雄蕊發(fā)育、體細(xì)胞胚發(fā)生、初生根伸長(zhǎng)、苞片發(fā)育、休眠解除、葉片衰老、細(xì)胞程序性死亡等等發(fā)育過(guò)程中的特異表達(dá)基因，初步闡明了植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不同階段的轉(zhuǎn)變及不同器官形成的分子機(jī)理；通過(guò)比較不育系與可育系，不育系與恢復(fù)系，雜種與親本的差異表達(dá)基因，初步揭示了雄性不育、育性恢復(fù)、雜種優(yōu)勢(shì)等復(fù)雜生命現(xiàn)象的分子機(jī)理[11]。 2 次生代謝物合成相關(guān)的特異表達(dá)基因的分離植物的次生代謝物質(zhì)是大自然長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果，是植物生態(tài)適應(yīng)的重要手段。如各種植保素、木質(zhì)素是植物產(chǎn)生抗逆反應(yīng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)；生物堿、生氰苷等是植物防御動(dòng)物的有效武器；類黃酮中的花色苷、甜菜色素和番茄紅素等賦予植物花和果多彩的顏色，對(duì)物種的繁衍起著重要的作用。而且，植物的次生代謝物為人類提供了大量的醫(yī)藥和工業(yè)原料。如強(qiáng)心苷是心臟病的常規(guī)治療藥物；紅豆杉中的紫杉醇是天然的抗癌藥物；人參皂苷和銀杏黃酮更是傳統(tǒng)的保健良藥。植物的次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)生是植物發(fā)育過(guò)程中特異基因表達(dá)和調(diào)控的結(jié)果。分離控制次生代謝物質(zhì)合成的相關(guān)基因是人為調(diào)節(jié)和控制植物次生代謝，控制植物的生長(zhǎng)發(fā)育、改良植物品質(zhì)、增加產(chǎn)量的前提條件。目前，SSH技術(shù)已開(kāi)始應(yīng)用于次生代謝物合成相關(guān)基因的分離，但研究報(bào)道還較少。通過(guò)選取不同生長(zhǎng)時(shí)期、不同部位或不同處理的植物材料建立抑制性差減文庫(kù)，已經(jīng)分離到了部分調(diào)控次生代謝物質(zhì)合成的特異表達(dá)基因，初步揭示了部分次生代謝物質(zhì)合成的分子機(jī)理[12]。2．2 3 應(yīng)用SSH技術(shù)分離誘導(dǎo)型表達(dá)的抗性相關(guān)基因植物的抗性育種一直是育種工作的重要方面，分離抗性相關(guān)基因，了解和揭示植物抗性的分子機(jī)理，從而進(jìn)行轉(zhuǎn)基因育種無(wú)疑是快速培育植物抗性新品種的捷徑。目前SSH 技術(shù)已被成功應(yīng)用到植物抗性相關(guān)基因的分離中。生物脅迫(水分、干旱、鹽、熱、冷、輻射、離子毒害等等)與非生物脅迫(細(xì)菌、真菌、蟲(chóng)害等等)因素會(huì)在抑制某些基因表達(dá)的同時(shí)誘導(dǎo)另一些基因的表達(dá)，從而使植物體發(fā)生生理生化和外部形態(tài)的變化，表現(xiàn)出對(duì)外界脅迫的抗性。植物抗性的產(chǎn)生涉及到新陳代謝，蛋白質(zhì)的分解和合成，細(xì)胞膨壓的維持和細(xì)胞發(fā)育，葉綠素合成及光合作用，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等等多個(gè)方面，是由多基因控制的性狀，僅僅克隆某個(gè)或某一類基因遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能揭示植物抗性的分子機(jī)理，而利用SSH 技術(shù)一次可分離上千個(gè)差異表達(dá)的基因，因此該技術(shù)是分離植物抗性相關(guān)基因，揭示植物抗性分子機(jī)理的有力手段[13]。應(yīng)用SSH技術(shù)，將脅迫條件下的植物材料和非脅迫條件下的植物材料的cDNA 分別作為tester 或driver建立抑制性差減文庫(kù)；通過(guò)篩選，已經(jīng)獲得了一些與抗性相關(guān)的差異表達(dá)基因。在通過(guò)SSH技術(shù)分離差異表達(dá)基因的過(guò)程中還分離到了許多未知基因，如張巖等獲得的熱抗性相關(guān)基因中有33%為未知基因(Zhang et al, 2005)。Sahr等(2005b)發(fā)現(xiàn)了與銫抗性相關(guān)的19個(gè)未知基因。Agarwal和Glover (2005)%為未知基因，這些新基因的發(fā)現(xiàn)對(duì)于深入全面的揭示生命現(xiàn)象具有重要意義[14]。國(guó)內(nèi)外差異基因（片段）分離方法中應(yīng)用較廣泛的有DDRTPCR、cDNAAFLP、SAGE、SSH等。目前大白菜雄性不育相關(guān)基因的差異表達(dá)研究報(bào)道非常少：僅曹家樹(shù)等（2001）用DDRTPCR方法獲得一個(gè)白菜雄性不育兩用系可育株中特異表達(dá)的片段[15]。%的同源性。王永勤等(2003)利用cDNAAFLP技術(shù)分析白菜核雄性不育兩用系的表達(dá)差異時(shí)又找到兩條差異表達(dá)基因[16]。這些基因的發(fā)現(xiàn)為探索白菜雄性遺傳調(diào)控機(jī)制奠定了一定的基礎(chǔ)，但為了更清楚地了解大白菜核雄性不育的遺傳機(jī)制，必須盡快找到更多的差異表達(dá)基因。抑制消減雜交（Suppression Substractive Hybridization,SSH）技術(shù)與Dot blot或基因芯片結(jié)合的方法將是快速找到大量大白菜核雄性不育相關(guān)基因的有效方法。SSH技術(shù)是1996年由Diatchenko L等人提出的，該技術(shù)具有假陽(yáng)性率低、靈敏度高、高通量等優(yōu)點(diǎn)，已應(yīng)用到許多分子遺傳學(xué)和定位克隆的研究中[17]。1999年，Yang P等將SSH技術(shù)和cDNA芯片結(jié)合起來(lái)快速有效鑒定大量差別表達(dá)基因[18]。2004年張銀東等用SSH方法進(jìn)行了玉米溫敏型核雄性不育基因差異表達(dá)分析，構(gòu)建了差異表達(dá)消減cDNA文庫(kù)[19]。但運(yùn)用SSH方法進(jìn)行大白菜核雄性不育的研究尚未見(jiàn)有報(bào)道。本研究旨在通過(guò)SSH技術(shù)來(lái)分離獲得大量大白菜核雄性不育相關(guān)基因，并通過(guò)序列測(cè)定及生物信息學(xué)分析鑒定這些基因的功能，為揭示雄性不育遺傳機(jī)制奠定基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)[1]徐文玲，何啟偉， (山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所 濟(jì)南　250100)[2]李廣存，金黎平，(SSH)技術(shù)及其在植物基因分離上的應(yīng)用(； 250100)[3]Diatchenko L,lau Y F,Campbell A subtractive hybridization:a method for generating differentially regulator tissue 2specific cDNA probes and libraries[J].PROC Acad Sci USAM1996,93。60256030[4]Diatchenko L, Lau Y F,Campbell AP, subtractive hybridization: A method for generating differentially regulated or tissue specific cDNA probes and libraries[J]. Proc Natl Acad Sci,1996,93:60256 030.[5]李廣存，金黎平，（SSH）技術(shù)及其在植物基因分離上的應(yīng)用[J] .:249:2631.[6]Pascual L,Blanca JM ,Canizares J, ,173:609～6201[7]WongYY，HoCL，Nguyen PD，TeaS S，Harikrishna JA，Rahim RA,Wong MCV L．Isolation of salinity tolerant genes from the mangrove plant,Bruguiera cylindrica by using suppression