【正文】 參考文獻[1]徐文玲，何啟偉， (山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所 濟南　250100)[2]李廣存，金黎平，(SSH)技術(shù)及其在植物基因分離上的應(yīng)用(； 250100)[3]Diatchenko L,lau Y F,Campbell A subtractive hybridization:a method for generating differentially regulator tissue 2specific cDNA probes and libraries[J].PROC Acad Sci USAM1996,93。但運用SSH方法進行大白菜核雄性不育的研究尚未見有報道。1999年，Yang P等將SSH技術(shù)和cDNA芯片結(jié)合起來快速有效鑒定大量差別表達基因[18]。抑制消減雜交（Suppression Substractive Hybridization,SSH）技術(shù)與Dot blot或基因芯片結(jié)合的方法將是快速找到大量大白菜核雄性不育相關(guān)基因的有效方法。王永勤等(2003)利用cDNAAFLP技術(shù)分析白菜核雄性不育兩用系的表達差異時又找到兩條差異表達基因[16]。目前大白菜雄性不育相關(guān)基因的差異表達研究報道非常少：僅曹家樹等（2001）用DDRTPCR方法獲得一個白菜雄性不育兩用系可育株中特異表達的片段[15]。Agarwal和Glover (2005)%為未知基因，這些新基因的發(fā)現(xiàn)對于深入全面的揭示生命現(xiàn)象具有重要意義[14]。在通過SSH技術(shù)分離差異表達基因的過程中還分離到了許多未知基因，如張巖等獲得的熱抗性相關(guān)基因中有33%為未知基因(Zhang et al, 2005)。植物抗性的產(chǎn)生涉及到新陳代謝，蛋白質(zhì)的分解和合成，細胞膨壓的維持和細胞發(fā)育，葉綠素合成及光合作用，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等等多個方面，是由多基因控制的性狀，僅僅克隆某個或某一類基因遠遠不能揭示植物抗性的分子機理，而利用SSH 技術(shù)一次可分離上千個差異表達的基因，因此該技術(shù)是分離植物抗性相關(guān)基因，揭示植物抗性分子機理的有力手段[13]。目前SSH 技術(shù)已被成功應(yīng)用到植物抗性相關(guān)基因的分離中。通過選取不同生長時期、不同部位或不同處理的植物材料建立抑制性差減文庫，已經(jīng)分離到了部分調(diào)控次生代謝物質(zhì)合成的特異表達基因，初步揭示了部分次生代謝物質(zhì)合成的分子機理[12]。分離控制次生代謝物質(zhì)合成的相關(guān)基因是人為調(diào)節(jié)和控制植物次生代謝，控制植物的生長發(fā)育、改良植物品質(zhì)、增加產(chǎn)量的前提條件。如強心苷是心臟病的常規(guī)治療藥物；紅豆杉中的紫杉醇是天然的抗癌藥物；人參皂苷和銀杏黃酮更是傳統(tǒng)的保健良藥。如各種植保素、木質(zhì)素是植物產(chǎn)生抗逆反應(yīng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)；生物堿、生氰苷等是植物防御動物的有效武器；類黃酮中的花色苷、甜菜色素和番茄紅素等賦予植物花和果多彩的顏色，對物種的繁衍起著重要的作用。 1 植物生長發(fā)育過程中特異表達基因的分離應(yīng)用SSH技術(shù)，在植物體不同發(fā)育階段或同一植物體的不同器官分別取樣作為tester 和driver，建立抑制性差減文庫已分離到了花芽分生組織形成、花器官成熟、花粉管萌發(fā)、雄蕊發(fā)育、體細胞胚發(fā)生、初生根伸長、苞片發(fā)育、休眠解除、葉片衰老、細胞程序性死亡等等發(fā)育過程中的特異表達基因，初步闡明了植物生長發(fā)育過程中不同階段的轉(zhuǎn)變及不同器官形成的分子機理；通過比較不育系與可育系，不育系與恢復(fù)系，雜種與親本的差異表達基因，初步揭示了雄性不育、育性恢復(fù)、雜種優(yōu)勢等復(fù)雜生命現(xiàn)象的分子機理[11]。植物體從種子萌發(fā)，到根莖葉的生長發(fā)育、開花結(jié)果直至衰老和死亡的整個生命周期中，任何一個發(fā)育階段及相關(guān)的生命現(xiàn)象都是不同組織特異性基因表達的結(jié)果；而植物在逆境脅迫(生物及非生物脅迫)條件下產(chǎn)生的環(huán)境適應(yīng)性和抗性則多是誘導(dǎo)型基因表達的結(jié)果。另外，由于SSH技術(shù)的兩次差減雜交和兩次抑制性PCR的過程，可以分離到原本表達量很低的轉(zhuǎn)錄因子(FaivreRampant et al,2004)，這些基因的獲得對于揭示植物生長發(fā)育的分子機理具有重要作用[9]。 抑制性差減雜交(SSH)技術(shù)在分離植物差異表達基因中的應(yīng)用在植物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，SSH技術(shù)特別適合于分離發(fā)育階段轉(zhuǎn)型前后，個體內(nèi)不同器官之間，以及受環(huán)境因子影響較大的差異表達基因。Hiroyuki等(2005)通過研究豌豆對枯萎病的抗性反應(yīng),分別鑒定出155個病菌誘導(dǎo)上調(diào), 34個下調(diào)基因。王力華等(2004)為了獲得陸地棉黃矮病抗性相關(guān)候選基因,利用棉花黃矮病菌大麗輪枝菌毒素粗提物誘導(dǎo)耐黃矮病品種, 對得到的180個克隆進行反Northern雜交,篩選出15個陽性克隆,并對這15個EST進行了定位趙小蘭等(2005)利用SSH進行根癌農(nóng)桿菌脅迫下多花薔薇的基因表達分析, 所獲得的cDNA功能涉及細胞分裂、生長, 逆境防御、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及激素調(diào)節(jié)等功能。序列分析表明,部分序列的功能與抗病性明顯相關(guān)?？剐曰虻耐暾寺∵€不多[7]。 SSH技術(shù)在植物抗病性機制研究中的應(yīng)用SSH技術(shù)作為一種較為有效的分離差異表達基因的方法,已經(jīng)在植物抗病性機理研究上被廣泛應(yīng)用,并取得了一些進展。另一方面,在植物抵抗各種脅迫, 包括生物 和非生物因素的研究領(lǐng)域中,這項技術(shù)也已成為研究基因差異表達的重要工具,有助于揭示植物抗逆的分子機制。抑制差減雜交(SSH)技術(shù)的主要步驟有: (1)cDNA的合成與酶；(2)試驗組cDNA分成兩份,并與兩個不同的接頭連接；(3)試驗組的cDNA與過量的驅(qū)動組cDNA 雜交；(4)選擇性PCR 擴增與接頭相連的試驗組cDNA 分子；(5)克隆PCR 產(chǎn)物,構(gòu)建差減文庫；(6) 篩選文庫[5]。同時,該方法應(yīng)用了雜交的二級動力學(xué)原理,即豐度高的單鏈cDNA在退火時產(chǎn)生同源雜交的速度要快于豐度低的單鏈cDNA,從而使在雜交完畢后原來在豐度上有差異的單鏈cDNA達到均等化的目的。簡言之, SSH技術(shù)的原理可概括為“消同富異”,即消減同源序列,富集差異序列。近年來,無論在技術(shù)改良上還是在應(yīng)用研究中,抑制性消減雜交技術(shù)都取得了一些新進展[3]。抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)是一種比較、分離不同細胞系、不同組織間或同一細胞系、同一組織在不同條件下差異表達基因的方法。這些技術(shù)不依賴于已知基因的位置和功能,可以直接在基因組中從DNA和RNA水平獲得有意義的目的基因片段。SSH 技術(shù)是分離植物差異表達基因，揭示植物復(fù)雜生命現(xiàn)象分子機理的有效方法，將在植物差異表達基因研究中得到更廣泛的應(yīng)用[2]。首先，SSH 技術(shù)廣泛應(yīng)用在分離植物發(fā)育過程中不同發(fā)育階段和不同組織器官中的組織特異性表達的基因，為揭示植物生長發(fā)育過程的分子機理提供了有效手段；另外，在不同植物中，該技術(shù)被大量應(yīng)用于分離各種生物及非生物脅迫條件下誘導(dǎo)表達的抗性相關(guān)基因，可以揭示植物抗逆的分子機理。一個典型的SSH 過程，可在一個差減雜交過程中將稀有基因序列富集上千倍。抑制性差減雜交技術(shù)(SSH)是基于抑制PCR 作用的cDNA 差減雜交，是在轉(zhuǎn)錄水平上研究差異基因表達的技術(shù)。十九世紀傳入日本、歐美各國。白菜原產(chǎn)于我國北方，俗稱大白菜。要弄清雄性不育的遺傳機理有必要從研究決定雄性不育的基因入手，通過研究基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及其調(diào)控來探索雄性不育的機理。 目前本課題組已建立了一套該材料的應(yīng)用技術(shù)體系，并實現(xiàn)了品種間和亞種間核不育復(fù)等位基因的交流，育成了多個新的具有100%不育株率的雄性不育系。用“兩用系”不育株（MsMs）與臨時保持系（msms）交配，可以獲得具有100%不育株率的雄性不育系（MsMs msms174。配成不育系的“兩用系”不育株基因型為“MsMs”，可育株為“MsfMs”。100%不育株率的雄性不育材料最早是由本課題組于1991年在大白菜雄性不育“兩用系”輪配試驗中育成的，由于用傳統(tǒng)的單基因隱性或顯性遺傳無法解釋這種遺傳現(xiàn)象，從而提出了“大白菜核基因雄性不育復(fù)等位基因遺傳假說”（Feng Hui et al., 1995），并為后來的實驗所證實（Feng Hui et al., 1996）。由于細胞核雄性不育材料的雄蕊退化一般比較徹底、不育性穩(wěn)定、無不良性狀伴生，倍受育種工作者的重視。雄性不育系的利用是配制大白菜雜交種經(jīng)濟、可靠的制種手段(孫日飛，2000)。關(guān)鍵詞:大白菜；抑制性差減雜交(SSH)技術(shù)；核基因雄性不育大白菜為兩性花異花傳粉蔬菜作物，雜種優(yōu)勢十分顯著。目前，SSH 技術(shù)已開始應(yīng)用于分離與次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因。本文通過詳細分析該技術(shù)在植物差異表達基因分離中的應(yīng)用發(fā)現(xiàn)：SSH 技術(shù)主要用于分離組織特異性表達和誘導(dǎo)型表達的基因。該技術(shù)在一個循環(huán)過程中完成差異表達基因豐度的均等化及目標群體和對照群體中相同基因的去除，從而實現(xiàn)差異表達基因的高度富集。白菜是人們生活中不可缺少的一種重要蔬菜，味道鮮美可口，營養(yǎng)豐富，素有“菜中之王”的美稱，為廣大群眾所喜愛[1]。引種南方，南北各地均有栽培。承諾內(nèi)容：本畢業(yè)論文是本人在導(dǎo)師冀瑞琴老師指導(dǎo)下獨立完成的，沒有抄襲他人成果，對本文的研究作出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。表明該基因為大白菜花蕾發(fā)育調(diào)控基因，它對育性控制發(fā)生在花蕾發(fā)生初期就已起作用。不同等級大小花蕾中的時序表達結(jié)果顯示，各等級可育花蕾中均有同等程度的表達，而在不育花蕾中均不表達。這將需要進行更深入的研究。（二）通過結(jié)合蕓薹屬多國功能基因組結(jié)果獲得該基因的全長序列。本實驗結(jié)果與其基本一致。因此,花蕾中游離脯氨酸含量與煙草雄性不育性有密切的關(guān)系,不育系花蕾中脯氨酸含量低是雄性不育性導(dǎo)致的結(jié)果。劉齊元（2006）煙草游離脯氨酸含量與雄性不育性的關(guān)系結(jié)果表明,花蕾中不育系的脯氨酸含量在小花蕾階段與其保持系非常接近,但從中花蕾開始,保持系花蕾中的脯氨酸含量急劇上升,而不育系花蕾中的脯氨酸含量則基本保持穩(wěn)定,因而,不育系花蕾中的脯氨酸含量在大花蕾時期明顯低于其保持系?？捎ɡ僦谢ㄝ唷⒒ò?、雄蕊和雌蕊只在雄蕊中表達，而在其他花器官組織中均不表達。不同等級大小花蕾中的時序表達結(jié)果顯示，各等級可育花蕾中均有同等程度的表達，而在不育花蕾中均不表達。綜上所述此基因是脂肪酸脫飽和酶基因產(chǎn)生的不育性狀還是與脯氨酸富集蛋白基因及其遺傳機理還需進一步實驗驗證。根據(jù)比對結(jié)果推斷此基因也可能與脯氨酸富集蛋白基因有關(guān)，朱廣廉等（1984）曾對顯性單基因控制的太谷核不育小麥不同發(fā)育階段的可育株和不育株的花藥及雌蕊說明育性與脯氨酸的含量密切相關(guān)。開花時柱頭先伸出花朵，花瓣小且分離不重疊。 BFAPG基因的功能預(yù)測 根據(jù)全長序列提交(NCBI)數(shù)據(jù)庫BLAST進行序列相似性搜索，得出此基因與擬南芥胞外脂肪酶有95%的同源性，與蕓薹屬幾種作物的花粉專一性脯氨酸富集蛋白有66%的同源性，與玉米花藥專一性的脯氨酸富集蛋白有有72%的同源性。本部分試驗在RNA分離時使用了TIANGEN公司的離心柱型RNA提取試劑盒，步驟少、省時間、產(chǎn)量高，提取的RNA質(zhì)量好。因此RNA提取結(jié)束后，要根據(jù)大概產(chǎn)量稀釋到適當(dāng)濃度范圍，再用分光光度計測量。(8)將RNA樣品保存于一70℃下75%的乙醇中。(6)風(fēng)干時，不要讓RNA顆粒完全干燥，否則會大大降低它的溶解性。(4)酚/氯仿抽提時將水相和有機相之間的變性蛋白去除干凈。(2)在液氮中使樣品裂解完全?！?。 ng／ μl，以上為好，否則，合成的dscDNA產(chǎn)量低，達不到建庫的要求。M:Marker。結(jié)果發(fā)現(xiàn), ACTIN基因在所有的不育及可育植株的各等級花蕾中中均有相似表達，而目的基因BFAPG僅在雄蕊中有表達，而在花器官的其它部位均無表達（圖10），表明該基因為雄蕊特異表達基因。Marker。結(jié)果發(fā)現(xiàn), ACTIN基因在所有的不育及可育植株的各等級花蕾中中均有相似表達，而目的基因BFAPG僅在各等級可育花蕾中有表達，且表達水平基本一致，而在不育花蕾中沒有表達, 肉眼看不出有條帶產(chǎn)生（圖7），表明該基因為在一進入蕾期就開始起作用。 9分別為可育植株的須根、根、莖、葉、花蕾；10分別為不育植株的須根、根、莖、葉、花蕾。M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 BFAPG250bp500bp ACTIN500bp250bpACTIN ACTIN 圖6 BFAPG與ACTIN基因在不育及可育植株不同部位的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn), ACTIN基因在所有的不育及可育植株的須根、根、莖、葉、花蕾各個部位中均有相似表達，表明以ACTIN基因作不育基因研究的內(nèi)標基因是可靠的。 acyltransferase/ carboxylesterase/ lipase (EXL6) mRNA, plete cds95%1Arabidopsis thaliana family II extracellular lipase 5 (EXL5) (AT1G75920) mRNA, plete cds96%1Arabidopsis thaliana EXL4。 與擬南芥胞外脂肪酶EXL6 ()、EXL5 ()、EXL4 ()、EXL3（）及EXL2（）mRNA分別有95%、96%、91%、67%及68%的同源性；與蕓薹屬幾種作物的花粉專一性脯氨酸富集蛋白有66%：【與白菜（）、芥菜（）、甘藍（）】與毛果楊肉桂酰輔酶A莽草酸/N肉桂酸轉(zhuǎn)移酶蛋白HCQL5 mRNA（）有79%的同源性；與玉米花藥專一性的脯氨酸富集蛋白（）有72%的同源性。F 可育花蕾；S 不育花蕾 BFAPG基因全長獲得利用本課題組參與的“多國蕓薹屬植物基因組計劃項目”中大白菜Chiifu的BAC文庫與基因組測序結(jié)果信息資源，以BFAPG片段所獲得的全長序列如圖5，將全長序列與上述片段放入NCBI數(shù)據(jù)庫blastn進行雙序列比對（Ali