【正文】 。 參考文獻(xiàn) .............................................................................................. 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定 ............................................................... 錯(cuò)誤 !未 定義書(shū)簽。 菌落 PCR 鑒定 ........................................................................ 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 質(zhì)粒和目的基因片段酶切反應(yīng) .................................................. 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 ............................................................................ 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 PET28afasⅢ質(zhì)粒的少量制備 ......................................... 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 挑菌落做菌落 PCR ......................................................... 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 DNA 片段的體外連接 (目的基因?qū)胭|(zhì)粒載體 ) ............... 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 酶切 .............................................................................. 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 實(shí)驗(yàn)方法 ................................................................................. 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 引物 ............................................................................... 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 實(shí)驗(yàn)儀器 ....................................................................... 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 2 實(shí)驗(yàn)材料與方法 ................................................................................ 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 載體 ....................................................................................... 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 果蠅精巢的基 本特征 ............................................................... 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。還有我的爸爸媽媽?zhuān)霉?、舅舅?duì)我生活方方面面的關(guān)心，你們是我堅(jiān)強(qiáng)的后盾，是我溫馨的港灣，愿你們一生平安幸福！ 費(fèi)紫薇 2020 年 4 月 目錄 摘 要 ................................................................................................. 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。感謝你們的陪伴與幫助，尤其感謝師姐師兄對(duì) 我的耐心指導(dǎo)和悉心解說(shuō)，給予我很大的幫助 ，讓我受益匪淺， 在這里請(qǐng)接受我誠(chéng)摯的謝意。 陳 老師是我的良師，不僅在畢業(yè)論文期間給力我很大的幫助，同時(shí)在我考研期間也給了我很多寶貴的意見(jiàn)。在論文初稿到成稿的過(guò)程之中，不厭其煩的為我修改。 在論文實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和寫(xiě)作過(guò)程中，我得到了 陳冬生 老師極大地幫助和耐心的指導(dǎo)。這次的經(jīng)歷讓我受益匪淺 ， 同時(shí)也暴露出我在多方面的不足與缺陷。大學(xué)生活的結(jié)束，意味著我要踏上新的征程，再次揚(yáng)帆起航。轉(zhuǎn)眼間美好的大學(xué)四年生活已經(jīng)接近了尾聲，經(jīng)過(guò) 四年的學(xué)習(xí)我在各個(gè)方面都有所提高。利用 fasⅢ 表達(dá)蛋白制備多克隆抗體，可用于抗原抗體免疫熒光反應(yīng)，從而標(biāo)記 hub cell 的位置，更 利于了解和研究果蠅精巢結(jié)構(gòu)。 1 2 3 M 1 2 3 4 5 M 1000bp 20 圖 35 質(zhì)粒制備的鑒定 The Identification of plasmid M， DNA Marker； 1,2,3,重組質(zhì)粒 ； 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，鑒定結(jié)果如下圖 36 所示，雙 酶切后的產(chǎn)物為兩條帶，分別是目的基因 fasⅢ片段與質(zhì)粒 PET28a 片段，其中目的基因片段與 DNA Marker(15000bp)第一條帶對(duì)應(yīng)，質(zhì)粒 PET28a 片段與 DNA Marker 第四條帶對(duì)應(yīng)， 1， 2， 3，分別對(duì)應(yīng) EP 管上編號(hào)為 3， 4， 10 圖 36 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定 The rebinant plasmid was identified by double enzyme digestion 1， 2， 3，雙酶切產(chǎn)物； M， DNA Marker； 四、討論 實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了果蠅精巢 fasⅢ 基因原核表達(dá)載體，最終目的是實(shí)現(xiàn) fasⅢ蛋白的原核表達(dá)與純化，為以后制備多克隆抗體奠定基礎(chǔ)。 圖 34 菌落 PCR 的鑒定 The identification of colony PCR 1， 2， 3， 5，菌落 PCR 產(chǎn)物； 4，陽(yáng)性對(duì)照； M， DNA Marker； 質(zhì)粒制備的鑒定 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，鑒定結(jié)果如下圖 35 所示， 制備目的基因 fasⅢ 與PET28a 的重組質(zhì)粒，片段大小約 6000bp， 以 DNA Mamker(15000bp)作參考， 位于 Marker 第三條帶（ 5000bp）和第四條帶（ 7500bp）之間。目的條帶清晰明亮，回收效果較好。 圖 32 目的基因片段與質(zhì)粒酶切反應(yīng)后鑒定 The identification of target gene fragment and the plasmid 1，目的基因 fasⅢ的酶切結(jié)果； M， DNA Marker； 2，質(zhì)粒 PET28a 酶切結(jié)果； 瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒回收 DNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，鑒定結(jié)果如下圖 33 所示， 實(shí)驗(yàn)所用 DNA Marker 為15000bp，目的基因 fasⅢ為 950bp，與 Marker 第二條帶（ 1000bp）基本對(duì)應(yīng)。 1 2 M 1000bp 18 圖 31 目的基因 fasⅢ的 PCR 鑒定 Identification of PCR gene Fas III 1， 2；目的基因片段 M,DNA Marker； 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，鑒定結(jié)果如下圖 32 所示， 實(shí)驗(yàn)所用 DNA Marker 為15000bp，目的基因 fasⅢ為 950bp，與 Marker 第二條帶（ 1000bp）基本對(duì)應(yīng)。目的基因 fasⅢ為 950bp,與 Marker 第二條帶（ 1000bp）基本對(duì)應(yīng)。 以 15 kb DNA Mamker 作參考，判斷實(shí)驗(yàn)組條帶大小是否正確。 ３、 離心管中收集制備好的質(zhì)粒，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)： 分別取 3μ l 提取的質(zhì)粒 DNA 樣品與 2μl 10 loading buffer 混合后加到凝膠孔中開(kāi)始電泳，電泳結(jié)束后取出樣品，在紫外燈下觀察，攝像， 根據(jù)片段 大小判斷質(zhì)粒是否制備成功。 （ 9） 重復(fù)