原核基因表達(dá)及其調(diào)控(參考版)
2025-05-16 13:26本頁面
【正文】 PEG化的途徑： （ 1）用氰脲酰氯、 N羥基丁二酰等活化的 PEG可以與氨基發(fā)生反應(yīng)； （ 2）用馬來酸酐和 ?氨基乙酸活化的 PEG可以與巰基進(jìn)行反應(yīng)； （ 3） PEG可以與蛋白質(zhì)的羧基發(fā)生反應(yīng)。 多種分離純化技術(shù)的綜合運(yùn)用 （ 1）應(yīng)選擇不同分離純化機(jī)理的方法共同使用； （ 2）應(yīng)首先設(shè)法除去含量最多的雜質(zhì)； （ 3）要盡量采用高效分離方法； （ 4）要把最費(fèi)時(shí)、成本最高的分離方法安排在最后的階段 選擇合適的分離純化材料 要求： （ 1） 有較高的分離效率； （ 2）在分離純化過程中不會(huì)造成目的蛋白的變性； （ 3）化學(xué)和機(jī)械性能穩(wěn)定，重復(fù)性好； （ 4）成本較低 分離純化過程的規(guī)?；? 規(guī)模化可以降低成本。 一般等電點(diǎn)處于極端位置（ pI5或 pI8）的基因工程蛋白質(zhì)應(yīng)首選離子交換層析方法； （ 3） 不同蛋白質(zhì)可以選用不同的特異性親和配基。 針對(duì)不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)選用不同的層析類型 （ 1） 用離子交換層析分離具有不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)。 一般等電點(diǎn)處于極端位置（ pI5或 pI8）的基因工程蛋白質(zhì)應(yīng)首選離子交換層析方法； （ 3） 不同蛋白質(zhì)可以選用不同的特異性親和配基。 一般變性時(shí)要考慮以下幾方面的因素： ① 變性劑的濃度及變化率； ② 外源蛋白的濃度及其純度； ③ 氧化還原劑的選擇； ④ pH值的選擇； ⑤ 適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度； ⑥ 合適的溫度和作用時(shí)間； ⑦ 分子伴侶的作用（ chaperone） （二）表達(dá)蛋白純化的基本原則 針對(duì)不同的產(chǎn)物表達(dá)形式采取不同的策略； （ 1）對(duì)于體積大、濃度低的分泌蛋白體系，先通常先要進(jìn)行濃縮處理， 如沉淀、超濾； （ 2）可溶性表達(dá)產(chǎn)物先用親和層析法進(jìn)行純化； （ 3）對(duì)于在壁膜間隙中表達(dá)的蛋白介于分泌性蛋白和細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白兩者之間，可以先用 低濃度溶菌酶 處理，再用滲透壓休克法進(jìn)行純化； 針對(duì)不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)選用不同的層析類型 （ 1） 用離子交換層析分離具有不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)。 鹽酸胍的溶解效率很高，可以達(dá)到 95％以上，且溶解速度快，因而不會(huì)對(duì)外源蛋白進(jìn)行共價(jià)修飾。在復(fù)性后不會(huì)造成蛋白質(zhì)的嚴(yán)重?fù)p失，同時(shí)還可以選用多種層析方法對(duì)提取到的包含體進(jìn)行純化。 ② 尿素和鹽酸胍 ：對(duì)包含體的氫鍵有較強(qiáng)的可逆變性作用。 ① SDS：是曾經(jīng)廣泛使用的溶解劑，可以在低濃度（ 1％）下使包含體溶解。加入的洗滌液可以通過柱層析等方法除去。 菌體常用破碎方法： ① 物理方法： Sonication/French Pressure ② 化學(xué)方法： Lysozyme（溶菌酶）、表面活性劑、 強(qiáng)堿（須考慮外源蛋白的耐受性） 洗滌目的：去除吸附在包含體表面的不溶性雜蛋白。加入的洗滌液可以通過柱層析等方法除去。 菌體常用破碎方法： ① 物理方法： Sonication/French Pressure ② 化學(xué)方法： Lysozyme（溶菌酶）、表面活性劑、 強(qiáng)堿（須考慮外源蛋白的耐受性） 洗滌目的：去除吸附在包含體表面的不溶性雜蛋白。 在大腸桿菌中所表達(dá)的外援蛋白大部分都是以包含體的形式存在。 （ 2） C端有分泌信號(hào)的蛋白： ?溶血素（ ?hemolysin） : 可完全分泌到培養(yǎng)基中。 A、雙交換的發(fā)生： 僅目的基因整合到染色體上 B、單交換： 整個(gè)質(zhì)粒整合到染色體上 使用 Marker可以很方便 地篩選整合重組菌株 ?淀粉酶基因整合到染色體上的拷貝數(shù)與未發(fā)生整合但由多 拷貝質(zhì)粒攜帶時(shí)表達(dá)活性的比較 （十一）外源蛋白的分泌 分泌途徑： （ 1） 分泌到周質(zhì)區(qū)（周質(zhì)空間） ； （ 2）完全分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中。 （十）將外源基因整合入染色體上 （ 1） 相對(duì)穩(wěn)定地存在，沒有選擇壓力時(shí)也可長期保存 ； （ 2）外源基因的整合位點(diǎn)不能位于對(duì)宿主菌特別重要的基因內(nèi)部； （ 3）一般整合到染色體上的目的基因最好也是由可調(diào)控的啟動(dòng)子進(jìn)行調(diào)控。 （ 3）在可能的情況下，改變蛋白質(zhì)中的 “ PEST”序列，但這種改變不能影響蛋白質(zhì)的功能。一般可以通過在 N端增加 1個(gè)或幾個(gè)氨基酸，來使蛋白質(zhì)的半衰期延長。決定于： （ 1） 二硫鍵 形成情況。 （九）增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性 構(gòu)建和表達(dá)長半衰期的外源蛋白。 （八）單一方向串連排列的基因 在低拷貝質(zhì)粒中表達(dá)多個(gè)串連排列的基因，以增加蛋白的表達(dá)量。 融合蛋白的應(yīng)用 （ 1）在大多數(shù)情況下，融合蛋白本身就是很好的終產(chǎn)物，無需處理，如可以用融合蛋白來制備抗體； （ 2）由于融合蛋白的某些功能單元，可以用于簡化提純步驟。 融合蛋白的純化 將融合蛋白分割成宿主蛋白和外源蛋白的策略： （ 1）在融合蛋白和宿主蛋白之間加入一段可被蛋白酶識(shí)別的氨基酸序列，如 IleGluGlyArg可被溶血因子 X?識(shí)別并在 C端切開，并且這一段序列在自然狀態(tài)下很少出現(xiàn)，因此可以用于分割融合蛋白； （ 2）在胰島素中沒有 Met，因此在基因工程胰島素和宿主蛋白之間可以加入一個(gè) Met，而表達(dá)的融合蛋白的 Met在體外可以被 CNBr轉(zhuǎn)移性識(shí)別和切割，從而形成 2條多肽鏈， 1條是胰島素，另 1條是宿主多肽。 pPC?載體組中每一個(gè)載 體 lacZ啟動(dòng)子、 SD序列和 lacZ 基因的前 8個(gè)氨基酸編碼序 列，在 lacZ的下游有 1個(gè) EcoRI位點(diǎn)； pPC???Z1的 EcoRI位點(diǎn)保 持不變
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