【正文】 溶原 VS溶菌 在噬菌體侵染的最后階段，會(huì)出現(xiàn)一個(gè)決定點(diǎn)―decision point‖ ，即 cro 和 cI兩蛋白間的競爭 cro 蛋白先產(chǎn)生，然后 cII (from PR) 和 cIII (from PL). ?cII 和 cIII 促進(jìn) cI 的產(chǎn)生 ?決定于兩個(gè)蛋白豐度水平的高低 溶菌途徑的誘導(dǎo) 1. 在大腸桿菌中 DNA 損傷能活化 RecA 蛋白 . 2. RecA 促進(jìn) l repressor 的降解 . 3. Repressor 從 OR1OR2解離，從而促進(jìn)從 PR 和 PL的轉(zhuǎn)錄 . 4. 從而導(dǎo)致溶菌生長 . ? UV 誘導(dǎo) 溶菌途徑的誘導(dǎo) ?侵入一個(gè)細(xì)胞的噬菌體顆粒的多少 CII 蛋白產(chǎn)生的越多， λ噬菌體 越有更多的機(jī)會(huì)進(jìn)入溶原途徑 ?大腸桿菌的生長狀態(tài) 侵染健康和生長旺盛的細(xì)菌細(xì)胞， CII 不穩(wěn)定，進(jìn)入溶菌途徑 相反，則易進(jìn)入溶原途徑 [CII 被特異蛋白酶 FtsH所降解 。 Cro 與 OR3 的結(jié)合能力最強(qiáng)， OR2次之， OR1最弱。 操縱子模型 lac 其它水平 調(diào)控原理 小結(jié) 其它 Trp 噬菌體策略 : 溶原途徑的建立 l repressor 的結(jié)合促進(jìn) PRM 的轉(zhuǎn)錄，維持 l repressor 的產(chǎn)生并抑制其他蛋白的生產(chǎn)從而建立溶原途徑 操縱子模型 lac 其它水平 小結(jié) 其它 Trp 噬菌體策略 : 溶菌途徑的建立 宿主 RNA Polymerase 識別 PL和 PR并轉(zhuǎn)錄 N 和 cro蛋白 噬菌體策略 : 溶菌途徑的建立 在 ―決定點(diǎn) ‖, cro 和 cI 間的競爭，它們均結(jié)合 OR. lac 其它水平 小結(jié) 其它 Trp 噬菌體策略 : 溶菌途徑的建立 但是 CⅠ 和 Cro 結(jié)合的親和力存在很大差異 l repressor與 OR1 的結(jié)合能力最強(qiáng)， OR2次之，OR3最弱。對的 OR3結(jié)合力是 OR2 ， OR1的十倍。對的 OR1結(jié)合力是 OR2的十倍。 l噬菌體 : 復(fù)雜的操縱子 ? 四個(gè)操縱子 : 左 , 右 , 晚 和阻遏蛋白 ? 左右操縱子包含用于 DNA復(fù)制，重組和噬菌體整合所需基因 ? 晚期操縱子含有編碼噬菌體頭，尾蛋白和裂解宿主細(xì)胞所需蛋白 . l噬菌體基因組的兩種存在方式：線狀和環(huán)狀 成熟噬菌體內(nèi)以線狀 侵入宿主細(xì)胞后環(huán)狀 溶原溶菌周期怎么調(diào)控 ? 調(diào)控蛋白和 調(diào)控元件 1. 不同的基因表達(dá)方式控制溶原和溶菌途徑 2. 調(diào)控蛋白和它們的結(jié)合位點(diǎn) cI 基因編碼 l repressor（阻遏蛋白） , 能夠抑制或促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄 作為阻遏蛋白 :結(jié)合位點(diǎn)和啟動(dòng)子序列重合，抑制 RNA聚合酶的結(jié)合 作為激活蛋白 : 和 CAP 類似，幫助募集 RNA聚合酶結(jié)合到啟動(dòng)子上 溶原溶菌周期怎么調(diào)控 ? 調(diào)控蛋白和 調(diào)控元件 Cro 阻遏蛋白：由 66個(gè)氨基酸組成，只有一個(gè)功能區(qū)，以二聚體形式與對稱的操縱區(qū)結(jié)合以阻遏轉(zhuǎn)錄的發(fā)生，只有阻遏活性。 ? T7噬菌體 RNA聚合酶的代換 ? 噬菌體產(chǎn)物將宿主的 RNApol磷酸化并以其抑制劑產(chǎn)物抑制RNApol的活性，同時(shí)產(chǎn)生自身的 RNApol。 ?T4噬菌體修飾核心酶并替換 σ 亞基改變宿主的轉(zhuǎn)錄對象。 細(xì)菌中 DNA和蛋白質(zhì)的相互作用 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 ? 各種蛋白包括 CAP， lac阻遏物等均有共同的結(jié)構(gòu)motif，即 helixturnhelix motif (HTH). ? 識別 helix 能嵌入 DNA的大溝中，另一螺旋跨過DNA，幫助識別螺旋的定位或增強(qiáng)與 DNA的結(jié)合強(qiáng)度 . ? 結(jié)合特異性依賴識別螺旋的某些氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)和DNA大溝中的某些堿基功能基團(tuán)的特異性結(jié)合，以及與 DNA骨架上磷酸基團(tuán)的特異性結(jié)合 . ? DNA結(jié)合的靶位點(diǎn)一般是對稱或重復(fù)性的，因?yàn)榇蠖嗟鞍诪槎垠w或多聚體 . 噬菌體基因的表達(dá)調(diào)控 噬菌體的生活周期 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 溶源途徑 裂解途徑 ?噬菌體的調(diào)控是級聯(lián)式的，有層次的 ? 前一階段的表達(dá)產(chǎn)物是下一階段基因表達(dá)所必須的蛋白因子 ? 早期基因，晚早期基因和晚期基因 噬菌體裂解過程中的基因表達(dá)調(diào)控是級聯(lián)反應(yīng) 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 ?噬菌體 SPO1以替換 σ 亞基改變宿主的轉(zhuǎn)錄對象 ? SPO1感染枯草桿菌，其早期基因啟動(dòng)子和細(xì)菌基因相同。 ? 精密調(diào)節(jié)基因的表達(dá)強(qiáng)度，對維持細(xì)菌生存及對環(huán)境的適應(yīng)十分重要。 根據(jù)激活蛋白的作用性質(zhì)分為 正控誘導(dǎo) 和 正控阻遏 ? 在 正控誘導(dǎo) 系統(tǒng)中，效應(yīng)物分子（誘導(dǎo)物）的存在使激活蛋白處于活性狀態(tài)； ? 在 正控阻遏 系統(tǒng)中，效應(yīng)物分子（ 輔阻遏物） 的存在使激活蛋白處于非活性狀態(tài) 。 根據(jù)其作用特征又可分為 負(fù)控誘導(dǎo) 和 負(fù)控阻遏 ： ? 在 負(fù)控誘導(dǎo) 系統(tǒng)中 ， 阻遏蛋白與效應(yīng)物 （ 誘導(dǎo)物 ）結(jié)合時(shí) ， 結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄； ? 在 負(fù)控阻遏 系統(tǒng)中 ， 阻遏蛋白與效應(yīng)物 （ 輔阻遏物） 結(jié)合時(shí) ， 結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄 。 例： 色氨酸操縱子 合成代謝蛋白的基因 酶合成的阻遏操縱子模型 調(diào)節(jié)基因 操縱基因 結(jié)構(gòu)基因 mRNA 酶蛋白 調(diào)節(jié)基因 操縱基因 結(jié)構(gòu)基因 輔阻遏物 輻阻遏物 如果某種物質(zhì)能夠阻止細(xì)菌產(chǎn)生合成這種物質(zhì)的酶，這種物質(zhì)就是輔阻遏物。 例： 大腸桿菌的乳糖操縱子 分解代謝蛋白的基因 根據(jù)操縱子對某些能調(diào)節(jié)它們的小分子的應(yīng)答，可分為 可誘導(dǎo)調(diào)節(jié) 和 可阻遏調(diào)節(jié) 兩大類： 調(diào)節(jié)基因 操縱基因 結(jié)構(gòu)基因 阻遏蛋白 調(diào)節(jié)基因 操縱基因 結(jié)構(gòu)基因 阻遏蛋白 誘導(dǎo)物 mRNA 酶蛋白 酶合成的誘導(dǎo)操縱子模型 誘導(dǎo)物 如果某種物質(zhì)能夠促使細(xì)菌產(chǎn)生酶來分解它，這種物質(zhì)就是誘導(dǎo)物。 調(diào)節(jié)基因 操縱基因 結(jié)構(gòu)基因 阻遏蛋白 激活蛋白 正轉(zhuǎn)錄調(diào)控 負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控 負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控 在沒有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)存在時(shí)基因是表達(dá)的，加入這種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)后基因表達(dá)活性便被關(guān)閉，這樣的調(diào)控負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控。 ? 應(yīng)急應(yīng)答使 rRNA和 tRNA的合成下降到原來6%，使得總 RNA合成的量僅為應(yīng)答前的 5％～ 10％，某些 mRNA的合成也下降至原有水平的 30%，核苷酸、糖和脂類等的合成量也下降，而蛋白質(zhì)降解速度加快。 (p)ppGpp的產(chǎn)生能關(guān)閉許多基因表達(dá)，只開放個(gè)別必須要合成氨基酸的基因，以應(yīng)對其生存危機(jī)。 ? 空載的 tRNA是產(chǎn)生這兩種物質(zhì)的誘導(dǎo)物 。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 ? 這些核苷酸是典型的小分子效應(yīng)物，能與相應(yīng)的目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合，使其活性發(fā)生改變 ? 將它們合稱為： (p)ppGpp (p)ppGpp能協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的許多基因表達(dá)過程。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 ? 發(fā)出這種應(yīng)急反應(yīng)信號的物質(zhì)是位于核糖體 A位點(diǎn)上的 未裝載氨基酸的 tRNA(空載 tRNA) ? 應(yīng)急應(yīng)答反應(yīng)引起 ppGpp和 pppGpp兩種異常核苷酸大量增加。但細(xì)菌有時(shí)會(huì)遇到 能源十分缺乏的狀況。 ② 無半乳糖時(shí)， R和 CAP均結(jié)合 OE， 阻遏 RNApol的轉(zhuǎn)錄。 半乳糖操縱子 (galactose operon) 結(jié)構(gòu)基因 gal操縱子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： ① 它有兩個(gè)啟動(dòng)子，其 mRNA可從兩個(gè)不同的起始點(diǎn)開始轉(zhuǎn)錄； ② 它有兩個(gè)操縱基因 O，一個(gè)在 P區(qū)上游，另一個(gè)在 galE內(nèi)部。 ? 控制弱化作用的二級結(jié)構(gòu)的改變由核糖體在mRNA上的位置決定。 ? 弱化子 mRNA可在分子內(nèi)采取不同的堿基配對方式，形成特殊的二級結(jié)構(gòu)參與對轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)控。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 ? 弱化作用是控制 RNA聚合酶通讀弱化子能力的調(diào)控作用機(jī)制。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 ? 這種情況下大腸桿菌可以在 23分鐘內(nèi)完全關(guān)閉色氨酸操縱子， 它使細(xì)菌避免利用自身資源進(jìn)行不必要的合成。 Phe操縱子 中同樣存在弱化子結(jié)構(gòu)，其前導(dǎo)序列中也有 7個(gè) Phe密碼子 . 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 ? 在這種調(diào)節(jié)方式中， 起信號作用的是細(xì)胞中某一氨基酸或嘧啶的濃度和有特殊負(fù)載的氨基酰 tRNA 的濃度。 每個(gè)操縱子的前導(dǎo)肽中都含有該操縱子所要調(diào)控的重復(fù)密碼子，如在 Trp前導(dǎo)肽第 10和第11位上有相鄰的兩個(gè) Trp密碼子。 ? 弱化子對基因表達(dá)活性的影響 普遍存在 于大腸桿菌氨基酸生物合成的操縱子中。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 ? 色氨酸含量變化對阻遏過程和弱化過程的作用方向是相同的。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 歸納： Attenuator (衰減子 )：提前終止轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)基因表達(dá)的功能區(qū)域，是在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)前導(dǎo)序列：162nt 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 ? 當(dāng)培養(yǎng)基中 色氨酸濃度高時(shí) ， 核糖體可順利通過兩個(gè)相鄰的色氨酸密碼子，在 4區(qū)被轉(zhuǎn)錄之前，核糖體就到達(dá) 2區(qū)，這樣使 23不能配對，34區(qū)可以自由配對形成莖 環(huán)式的終止子結(jié)構(gòu)，使得只有約 10％的 RNA聚合酶能繼續(xù)參與色氨酸操縱子結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。 Trp操縱子的衰減子區(qū)序列 色氨酸濃度高引起聚合酶提前終止轉(zhuǎn)錄的另一個(gè)原因是在衰減子中有能形成轉(zhuǎn)錄終止信號的序列及隨后連續(xù)排列的 8個(gè) AT堿基對。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 在缺乏 Trp時(shí) ,所有的 RNA聚合酶都能經(jīng)過弱化子繼續(xù)參與轉(zhuǎn)錄。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 當(dāng)培養(yǎng)基中 Trp濃度很低時(shí) ，負(fù)載有Trp的 tRNATrp很少， 翻譯通過兩個(gè)相鄰色氨酸密碼子的速度很慢，當(dāng)4區(qū)被轉(zhuǎn)錄完成時(shí)，核糖體才進(jìn)行到 1區(qū) （或停留在兩個(gè)相鄰的色氨酸密碼子處） 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 這時(shí)前導(dǎo)區(qū)結(jié)構(gòu)是23配對，不形成34配對的終止結(jié)構(gòu)。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 3 轉(zhuǎn)錄的 弱化效應(yīng) ? 轉(zhuǎn)錄弱化理論認(rèn)為， mRNA轉(zhuǎn)錄的終止是通過前導(dǎo)肽基因的翻譯進(jìn)行調(diào)節(jié)的 . ? 在前導(dǎo)肽基因中有 兩個(gè)相鄰的色氨酸密碼子 ，在翻譯時(shí)對 tRNATrp 的濃度 十分敏感。 ? 分析前導(dǎo)序列，發(fā)現(xiàn)它 包括起始密碼子 AUG和終止密碼子 UGA；當(dāng)翻譯起始于 AUG，則產(chǎn)生一個(gè)含有 14個(gè)氨基酸的多肽，稱 前導(dǎo)肽 ? 在色氨酸操縱子 mRNA的 AUG密碼子 5′端有一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)。 ? 繼續(xù)研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)合成起始后，除非培養(yǎng)基中完全沒有 Trp ，否則轉(zhuǎn)錄總在這個(gè)區(qū)域終止 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 ? 因?yàn)檗D(zhuǎn)錄終止發(fā)生在這一區(qū)域，且這種終止能被調(diào)節(jié)，因此這個(gè)區(qū)域被稱為 弱化子( attenuator )， 或 衰減子 ? 對引起終止的 mRNA堿基序列研究發(fā)現(xiàn)， 這一區(qū)域的 mRNA序列可通過自我配對形成莖 環(huán)結(jié)構(gòu)，具有典型的終止子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 原因？ ? 當(dāng) mRNA轉(zhuǎn)錄起始后，如果培養(yǎng)基中 存在一定水平的 Trp ，轉(zhuǎn)錄能被啟動(dòng)，但在這個(gè)區(qū)域停止，產(chǎn)生一個(gè) 140nt的 RNA分子； ? 如果 沒有 Trp存在，則轉(zhuǎn)錄繼續(xù)進(jìn)行，合成trpE mRNA。 ? Trp操縱子的 第二水平控制是 Trp操縱子的弱化系統(tǒng)， 決定已經(jīng)啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄是否能繼續(xù)進(jìn)行下去。 trp體系參與生物合成而不是降解，它不受葡萄糖或 cAMPCAP的調(diào)控。 ? 但當(dāng)在培養(yǎng)基中的 Trp過量時(shí)，它作為 輔阻遏物 與阻遏蛋白形成復(fù)合體，結(jié)合到操縱基因上阻止結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄， ? 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 這種以終產(chǎn)物阻止基因的轉(zhuǎn)錄稱反饋?zhàn)瓒?,此終產(chǎn)物（ Trp）稱為輔阻遏物。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 色氨酸操縱子 Tryptophane operon Trp 大腸桿菌的 Trp操縱子是 受阻遏物負(fù)調(diào)控的氨基酸生物合成操縱子的實(shí)例 Trp操縱子包括 5個(gè)結(jié)構(gòu)基因 trpA 、 B、 C、 D、 E 負(fù)責(zé) Trp的生物合成