原核基因表達(dá)及其調(diào)控-wenkub.com
2025-05-08 13:26 本頁(yè)面
【正文】 （三）表達(dá)蛋白的 PEG化 對(duì)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚乙二醇（ polyethylene glycol, PEG）修飾，以達(dá)到降低免疫原性，延長(zhǎng)半衰期，保持藥效活性的目的。 通常選擇各蛋白質(zhì)的滴定曲線沒(méi)有交叉的 pH值作為緩沖液的 pH值，同時(shí)還應(yīng)考慮該蛋白質(zhì)在該 pH值下的穩(wěn)定性和溶解性； （ 2） 用離子交換層析分離等電點(diǎn)相同但表面電荷分布不同的蛋白質(zhì)。 通常選擇各蛋白質(zhì)的滴定曲線沒(méi)有交叉的 pH值作為緩沖液的 pH值，同時(shí)還應(yīng)考慮該蛋白質(zhì)在該 pH值下的穩(wěn)定性和溶解性； （ 2） 用離子交換層析分離等電點(diǎn)相同但表面電荷分布不同的蛋白質(zhì)。目前，尿素已被廣泛用于包含體的溶解。但是結(jié)合到外源蛋白上的 SDS分子 很難除去 ，這種蛋白作為藥物使用的話，可能會(huì)造成流產(chǎn)；同時(shí)少量氧化物的存在會(huì)造成外源蛋白的共價(jià)修飾，因此目前很多國(guó)家的政府機(jī)構(gòu)，已經(jīng)禁止用 SDS溶解的蛋白產(chǎn)品上市。常用洗滌液： ① 1%以下的中性去垢劑，如 Tween、 Triton、 NP40等； ② 可以在中性去垢劑中再添加 EDTA和 二硫蘇糖醇（ DTT）、巰基乙醇 等還原劑，并保持 NaCl的濃度為 50 mM； ③ 低濃度 鹽酸胍 或 中性去垢劑、 EDTA及 還原劑 共同使用。常用洗滌液： ① 1%以下的中性去垢劑，如 Tween、 Triton、 NP40等； ② 可以在中性去垢劑中再添加 EDTA和 二硫蘇糖醇（ DTT）、巰基乙醇 等還原劑，并保持 NaCl的濃度為 50 mM； ③ 低濃度 鹽酸胍 或 中性去垢劑、 EDTA及 還原劑 共同使用。 （一）包含體蛋白的提取 包含體蛋白： Inclusion body 在大腸桿菌中當(dāng)外源蛋白的表達(dá)量達(dá)到 20％時(shí)，由于表達(dá)部位的低電勢(shì)和外源蛋白分子的特殊結(jié)構(gòu)（如富含 Cys、無(wú)糖基化等），使外源蛋白與其周圍的其它雜蛋白及其核酸一起形成的一種不溶性的結(jié)構(gòu)。 外源基因的整合途徑： （ 1） 轉(zhuǎn)座作用 （包括插入序列）； （ 2） 同源交換 。如：在 ?半乳糖苷酶的 N端加上不同的氨基酸，體外存活的時(shí)間可以從 2分鐘到 20小時(shí)不等。 正常情況下蛋白質(zhì)的半衰期：從 幾分鐘 到 幾小時(shí) 不等。 現(xiàn)已開(kāi)發(fā)大量的表達(dá)融合蛋白的商業(yè)性載體： 如 Invitrogen公司： 細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)： pBADHis系列、 pTrcHis系列等， 酵母菌表達(dá)系統(tǒng)： 、 pPIC9K等多種 。 pPC???Z2的 EcoRI位點(diǎn)之 前多了 2個(gè) G，經(jīng) EcoRI酶切 后的為 GGG； pPC???Z3的 EcoRI位點(diǎn)之 前多了 4個(gè) G，經(jīng) EcoRI酶切 后的為 GGGGG。 （七）融合蛋白的表達(dá)及純化 指所表達(dá)的外源蛋白與一種宿主蛋白共價(jià)連接，構(gòu)成融合蛋白。 Ion為 E. coli合成蛋白酶的主要底物。 表達(dá)非融合蛋白的優(yōu)勢(shì)： 單基因產(chǎn)物，不受其它蛋白質(zhì)成分的干擾，有利于其展現(xiàn)完整功能和保持活性。 廣 宿 主 載 體 （六）非融合蛋白的表達(dá) 指所表達(dá)的外源蛋白的 N末端不含有其它任何氨基酸，因此要求其翻譯起始位點(diǎn) ATG必須要位于其基因的 5’端。 A 培養(yǎng)基中不存在色氨酸 B 培養(yǎng)基中不存在色氨酸 cI蛋白合成 （脫阻遏） 無(wú)克隆基因蛋白 合成（阻遏） 克隆基 因蛋白 合成 （脫阻遏 ） cI蛋白不合成 （阻遏） （五）在其它微生物中的表達(dá) 除了 E. coli以外，有些微生物也可以用作表達(dá)外源蛋白的宿主菌（受體菌）。 電泳后回收片段 c 電泳后回收片段 1和 3 連接 由于 pKN402和 pCP3的復(fù)制子在 42?C時(shí)仍然具有很強(qiáng)的起始復(fù)制能力，因此當(dāng)培養(yǎng)溫度升高到 42?C時(shí)，細(xì)胞中的pKN402和 pCP3的拷貝數(shù)要比 pPLc2833高 5～ 10倍。 含 PL 啟動(dòng)子的表達(dá)載體： 是一種極強(qiáng)的啟動(dòng)子，所以被廣泛用于各種載體的 構(gòu)建； 如： pPL?。如： pKK2233。 pOP203系列表達(dá)載體： A family of cloning vectors containing the lacUV5 Promoter pOP2031,2, pOP2031 pOP2032 pOP2032 pOP2032 pOP20329 表達(dá)載體 pOP203質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖 含 trp 啟動(dòng)子的表達(dá)載體： （ 1） 產(chǎn)生的表達(dá)蛋白的量高于 lac啟動(dòng)子； （ 2） 所有含 trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體都受到 3?吲哚丙烯 酸（ IAA）的誘導(dǎo)。其最大的特點(diǎn)是帶有編碼 lacZ（ ?半乳糖苷酶 ）的編碼序列。 ?噬菌體左向操縱子結(jié)構(gòu)示意圖 PL 啟動(dòng)子 (二 )、常用原核表達(dá)載體 大量產(chǎn)物的獲得： （ 1）強(qiáng)的、可調(diào)控的啟動(dòng)子； （ 2） 翻譯效率； （ 3）新生肽穩(wěn)定性等。 Ptac 啟動(dòng)子 ： 是來(lái)自于 lac和 trp的一組雜合啟動(dòng)子，但是比 lac和 trp都強(qiáng)得多，是一組強(qiáng)啟動(dòng)子。 trp 啟動(dòng)子的脫阻遏可通過(guò)： （ 1）移除色氨酸； （ 2）加入色氨酸結(jié)構(gòu)類似物，如吲哚丙烯酸（ 3indoleacrylic acid） . 3’?吲哚丙烯酸 色氨酸操縱子（ trp operon） 由啟動(dòng)子、衰減子、操縱基因和色氨酸合成的 5種酶組成。 Glucose reduces CRP activiy CRP復(fù)合物形成促進(jìn)RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合 當(dāng) CAP與 cAMP協(xié)同作用時(shí)，其對(duì)啟動(dòng)子的親和性發(fā)生增強(qiáng)，而此時(shí)如果葡萄糖的量達(dá)到最低時(shí)，其親和性最高。 (3) lac 啟動(dòng)子由于與阻遏蛋白相結(jié)合而處于關(guān)閉狀態(tài)，但當(dāng)加入乳糖或者半乳糖苷結(jié)構(gòu)類似物，如異丙基硫代半乳糖苷（ IPTG）、硫甲基半乳糖苷（ TMG）和鄰硝基苯基半乳糖苷（ ONTG）后可發(fā)生脫阻遏作用。 四種簡(jiǎn)單類型控制通路 誘導(dǎo)作用是指存在誘導(dǎo)物能使阻遏蛋白失活，或者可激活一個(gè)激活蛋白而解除阻遏蛋白對(duì)轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程的阻遏； 阻遏作用是指一個(gè)輔阻遏物激活一種阻遏蛋白，或者使一種激活蛋
環(huán)評(píng)公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1