原核基因表達(dá)及其調(diào)控-文庫(kù)吧資料
2025-05-20 13:26本頁(yè)面
【正文】 ，其末端為 G。 融合蛋白的表達(dá) 1. “三夾板”式融合 2. 3. C末端融合 N末端融合 運(yùn)載蛋白 運(yùn)載蛋白 異源功能蛋白 運(yùn)載蛋白 運(yùn)載蛋白 異源功能蛋白 異源功能蛋白 通過(guò)在細(xì)胞膜跨膜蛋白中“鑲嵌”外源蛋白，是一種典型的 “三夾板”式融合方式 pPC?系列載體： pPC???Z1， pPC???Z2和 pPC???Z3?？梢詫?pin同時(shí)克隆到質(zhì)粒載體上。 （ 3）用蛋白酶抑制劑。如枯草芽孢桿菌（ Bacillus subtilis）蛋白酶活性強(qiáng)，而且具有外分泌性，但短芽孢桿菌（ Bacillus brevis）的蛋白酶活性就低得多； （ 2）用黃嘌呤營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株（ Ion－ ）作為受體菌。 不利方面： 容易受到受體菌蛋白酶的降解，產(chǎn)量較低。 （ 4）構(gòu)建融合蛋白。 表達(dá)非融合蛋白，一般要求其編碼基因的 ATG起始位點(diǎn)與核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ RBS）之間的距離要合適，否則即使僅相差 2~3個(gè) bp，表達(dá)效率也會(huì)大受影響。 該載體含有四環(huán)素抗性基因 (Tetr), 1個(gè) BglII 酶切位點(diǎn)，質(zhì)粒復(fù)制子，啟動(dòng)子和 1個(gè)多克隆位點(diǎn)（ a multiple cloning sequence， MCS)。 ?半乳糖苷酶在不同受體菌中的表達(dá)： 攜帶包含大腸桿菌 lacZ 基因和異源啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體的不同革蘭氏陰性菌受體菌中測(cè)定的 ? 半乳糖苷酶活性 ? G al acto sidas e a cti vity (U) in : Promoter Escher ichia coli Rh i zobium melil oti Rh i zobium legumi no s arum Pseud omo na s pu ti d a None 16 110 130 150 Nm 1,40 0 21 , 800 13 , 900 16 , 300 lac 2,00 0 9,05 0 6,25 0 9,80 0 tac 11 , 300 2,85 0 1,15 0 2,95 0 S1 40 3,30 0 1,20 0 3,35 0 苜蓿根瘤菌 豌豆根瘤菌 惡臭假單胞菌 大腸桿菌 ?半乳糖苷酶在不同受體菌中的表達(dá)分析： (1) 所有啟動(dòng)子在受體菌中都有一定的活性； (2) tac啟動(dòng)子在大腸桿菌中活性最高，但是在其它受體菌中活性最低； (3) 新霉素基因啟動(dòng)子（ Nm）是在大腸桿菌中活性最低的啟動(dòng)子，但是在其它受體菌中驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的活性卻最高。 “雙載體系統(tǒng)”特點(diǎn)： 1）當(dāng)培養(yǎng)基中 Trp含量較低時(shí)， trp啟動(dòng)子啟動(dòng)， cI阻遏蛋白合成，此時(shí) PL啟動(dòng)子受阻遏，目的基因不表達(dá)； 2）添加 Trp（可添加蛋白胨）以后， trp啟動(dòng)子受阻遏，而 PL啟動(dòng)子啟動(dòng)，此時(shí)可表達(dá)外源蛋白 。 溫度對(duì) 3種表達(dá)載體質(zhì)?？截悢?shù)的影響 （四）大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng) 小規(guī)模培養(yǎng)（ 1～ 5L）含表達(dá)載體的重組菌株時(shí)，其調(diào)控可以直接向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物，或者升高溫度，但是在半工業(yè)化（ 20～200L）或者工業(yè)化大規(guī)模（大于 200L）生產(chǎn)時(shí)，不能采用小規(guī)模的方法： （ 1）直接向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物如 IPTG，由于需要量較大，成本 高，不經(jīng)濟(jì)； （ 2）即使是使用溫度敏感的表達(dá)載體，升高溫度既需要較長(zhǎng)的時(shí) 間，又需要很大的能源消耗，成本也很高。 質(zhì)粒 pKN402的復(fù)制起始位點(diǎn)是耐溫型的，在 42?C時(shí)仍然有很強(qiáng)的復(fù)制起始的功能。 （ 1）來(lái)源于 pBR322, pBR322的 EcoRI/BamHI位點(diǎn) 被 PL 和 N基因取代； （ 2）外源基因可以插入到 N基因中的 HpaI位點(diǎn)； （ 3）當(dāng)培養(yǎng)溫度為 2931?C時(shí)， PL啟動(dòng)子處于阻遏 狀態(tài)；但當(dāng)溫度升到 42?C，發(fā)生脫阻遏。 pSE420 特點(diǎn)： 1） Ampr； 2） tac啟動(dòng)子； 3） lacZ核糖體結(jié)合部位； 4） ATG起始密碼子，位于 RBS下游 8bp處； 5）來(lái)源于 ?噬菌體的終止 子 T1和 T2，以避免其它 基因的過(guò)度轉(zhuǎn)錄。 pBADHisA, B, C。 多種商業(yè)化的載體。 如： pDR720 質(zhì)粒 pDR720是一個(gè)含 trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體，它來(lái)源于 p51， trp啟動(dòng)子在 Sma I位點(diǎn)插入，在啟動(dòng)子的下游有 3個(gè)位點(diǎn)， Sal I、 BamH I和 Sma I，可以插入外源基因。 pOP20313特點(diǎn) （ 1）為 pBR322衍生質(zhì)粒，插入 了強(qiáng)啟動(dòng)子 PlacUV5并在其下 游加入了 ?半乳糖苷酶 的 編碼序列（ ?gal） 21 bp 片斷和一個(gè) EcoRI位點(diǎn)； （ 2）其融合蛋白的 N端為 ?半乳 糖苷酶的前 7個(gè)氨基酸和 EcoRI接頭編碼的少數(shù)幾個(gè) 氨基酸，其 C端為完整的外 源蛋白。 當(dāng)外源基因插入后，如果能夠保持正確的 ORF，就可以形成由外源基因編碼的多肽和 ?半乳糖苷酶組成的融合蛋白。 含 lac 啟動(dòng)子的表達(dá)載體： 多種。 mRNA與核糖體的結(jié)合能力： （ 1） RBS與翻譯起始密碼子（ AUG）之間的距離要合適； （ 2）編碼從結(jié)合位點(diǎn)到起始幾個(gè)密碼子之間的的 DNA序 列不應(yīng)含有可能形成 環(huán)狀結(jié)構(gòu) 的序列，否則會(huì)妨礙 與核糖體的結(jié)合。 PL為 ?噬菌體左向早期啟動(dòng)子，控制基因從 N到 att的早期轉(zhuǎn)錄，受 到 cI所編碼的阻遏蛋白的調(diào)控。包括： （ 1） PtacI： PlacUV5的 10區(qū) ＋ Ptrp的 35區(qū)； （ 2） PtacII： Ptrp的 35區(qū)（一段合成的包括 Pribnow框在 內(nèi)的 46bp的 DNA） ＋ Plac的操縱基因； （ 3） Ptac12： Plac的 10區(qū) ＋ Ptrp的 35區(qū) 所有 Ptac都受 IPTG的誘導(dǎo)，同時(shí)受到阻遏蛋白的阻遏調(diào)控。 IAA是色氨酸的結(jié)構(gòu)競(jìng)爭(zhēng)類似物，它可以與阻遏蛋白結(jié)合而使其失去阻遏活性；不能再與操縱基因結(jié)合，從而不能阻遏轉(zhuǎn)錄過(guò)程。 （ 1）由 trpR產(chǎn)生的阻遏蛋白只有在與色氨酸結(jié)合后才能形成有活性的阻遏蛋白，它可以與操縱基因結(jié)合從而阻止轉(zhuǎn)錄的起始?？尚纬蓡?dòng)子 阻遏蛋白復(fù)合物。這樣，當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，高濃度的 cAMP水平能夠?qū)е氯樘遣倏v子的啟動(dòng)子發(fā)生高水平的轉(zhuǎn)錄作用。
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