【正文】 。 ara操縱子也有葡萄糖效應(yīng)。 當(dāng)誘導(dǎo)物阿拉伯糖存在時(shí)， AraC與阿拉伯糖結(jié)合為復(fù)合物， AraC的構(gòu)象改變?yōu)?Pi ， AraC以二聚體形式與 araI1和 araI2結(jié)合，失去與 araO2結(jié)合的能力，由此打開啟動(dòng)子使聚合酶結(jié)合激活 PBAD轉(zhuǎn)錄； 當(dāng)缺乏阿拉伯糖時(shí)， AraC處于 Pr構(gòu)象不結(jié)合 araI，而是結(jié)合 araO2，使DNA彎曲，阻礙 araBAD的表達(dá)。 ara操縱子的操縱基因受 AraC蛋白調(diào)節(jié)，其有兩種功能構(gòu)象，即正、負(fù)因子的雙重構(gòu)象， Pr是起阻遏的構(gòu)象可 與操縱區(qū)位點(diǎn)結(jié)合， Pi是誘導(dǎo)作用構(gòu)象，通過與 PBAD啟動(dòng)子結(jié)合而調(diào)節(jié)。無論阿拉伯糖與 AraC結(jié)合與否，或無論 ara操縱子控制區(qū)是否發(fā)生環(huán)化，這種控制事件均存在著。 ? 阿拉伯糖操縱子的自主調(diào)節(jié) ? 下圖顯示了 araC、 Pc和 araO1的相對(duì)位置： ? araC的轉(zhuǎn)錄從 Pc處起始從右向左進(jìn)行， araO1處于調(diào)控araC轉(zhuǎn)錄的位置上 (AraC蛋白結(jié)合到 araO1位點(diǎn)，阻止 Pc對(duì) araC的轉(zhuǎn)錄 )。 與 lac操縱子一樣，去阻遏并非是正調(diào)控的全部?jī)?nèi)容， CAPcAMP復(fù)合體介導(dǎo)的正調(diào)控也在發(fā)揮作用。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 當(dāng)阿拉伯糖缺乏時(shí)，細(xì)菌不需要 araBAD基因的表達(dá)產(chǎn)物，因此 AraC蛋白執(zhí)行負(fù)控制因子功能，結(jié)合在 araO2和 araI1位點(diǎn)，使兩個(gè)位點(diǎn)之間的 DNA環(huán)化，形成 阻遏環(huán)（ repression loop）操縱子受到阻遏。 ? 說明只要 2個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)位于 DNA雙螺旋的同一側(cè)，雙鏈 DNA分子就可以通過環(huán)化而使這 2個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)彼此靠近。 ? 研究發(fā)現(xiàn)，如果將具有整數(shù)雙螺旋轉(zhuǎn)角的 DNA片段 ( )插入操縱基因與啟動(dòng)子之間，操縱基因仍具有正常的功能。 CAP蛋白能協(xié)助解開因?yàn)?AraC與 araO2和 araI1結(jié)合而形成的 DNA彎曲，促使 AraC與 araI1和 araI2結(jié)合，從而激活 PBAD起始的轉(zhuǎn)錄。 AraC蛋白不僅調(diào)控 ara操縱子的轉(zhuǎn)錄，還調(diào)控其自身的轉(zhuǎn)錄。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 ? AraC蛋白的合成受其自身調(diào)節(jié)，同時(shí)也受 cAMPCAP調(diào)節(jié)。因此 AraC蛋白同時(shí)顯示正、負(fù)調(diào)節(jié)功能。 AraC蛋白有兩種構(gòu)象，即 正、負(fù)調(diào)節(jié)因子的雙重功能構(gòu)象 ， Pr是阻遏構(gòu)象，可與操縱區(qū)結(jié)合，而 Pi是誘導(dǎo)構(gòu)象，通過與 PBAD啟動(dòng)子結(jié)合進(jìn)行調(diào)節(jié)。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 阿拉伯糖操縱子的調(diào)節(jié)機(jī)制 ? ara操縱子的特征： ? ①存在 araO1和 araO2兩個(gè)操縱基因， araO1調(diào)節(jié)控制基因 araC轉(zhuǎn)錄， araO2位于其所控制的啟動(dòng)子 PBAD上游遠(yuǎn)端的 –265~–294處，發(fā)揮控制轉(zhuǎn)錄的功能； ? ② CAP結(jié)合位點(diǎn)位于 ara啟動(dòng)子上游約 200bp處，CAP具有促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的功能； ? ③ ara操縱子有由 AraC蛋白介導(dǎo)的負(fù)調(diào)控系統(tǒng)。在野生型操縱子中，只有阿拉伯糖存在時(shí)才轉(zhuǎn)錄 araBAD mRNA，有葡萄糖存在時(shí)則不發(fā)生轉(zhuǎn)錄。 AraBAD和 araC基因的轉(zhuǎn)錄以相反的方向進(jìn)行， araBAD基因簇從啟動(dòng)子PBAD開始向左進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，而 araC基因則是從PC向右進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 ? araE和 araF屬另外的操縱子，由同一啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 ? 這些酶以 araA、 araB、 araD的順序依次催化代謝，使阿拉伯糖轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿嵛焯谴x的中間產(chǎn)物木酮糖 5磷酸。大腸桿菌中阿拉伯糖的降解利用需要 3個(gè)基因： araB、 araA、和araD， 在操縱子上形成基因簇（ araBAD）。阿拉伯糖是五碳糖。因此，在操縱子系統(tǒng)中， 結(jié)合的阻遏蛋白與 RNA聚合酶都以不同的方式相互作用。 ? 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 ? RNA聚合酶、阻遏蛋白和啟動(dòng)子以及操縱基因區(qū)之間的相互作用在不同的操縱子系統(tǒng)中都不相同，因?yàn)樵谟械牟倏v子中，操縱基因不與啟動(dòng)子位于同一區(qū)，互不重迭。 ? 可見， RNA聚合酶和阻遏蛋白同時(shí)與 DNA結(jié)合，其 RNA聚合酶 阻遏蛋白 DNA復(fù)合物 被關(guān)閉階段不發(fā)生轉(zhuǎn)錄作用。S1。 ? 當(dāng)阻遏蛋白存在時(shí)，該常數(shù)增加 2個(gè)數(shù)量級(jí)達(dá) 109 Lmol1 但已結(jié)合的RNA聚合酶不能起始轉(zhuǎn)錄。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 3. 阻遏蛋白對(duì) RNA聚合酶功能的影響 ? 以往認(rèn)為，阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合阻止RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 ? 其它與操縱基因 DNA有不同親和力的突變的阻遏蛋白也有相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 （ 2） 誘導(dǎo)物對(duì)阻遏蛋白結(jié)合操縱基因的影響 主要表現(xiàn)：阻遏蛋白與 DNA結(jié)合與釋放是 快速動(dòng)態(tài)平衡 過程，誘導(dǎo)物與游離的阻遏蛋白結(jié)合后，使阻遏蛋白不能與 DNA結(jié)合，打破了平衡。 ? 許多原核生物基因調(diào)節(jié)蛋白中的阻遏蛋白都具有類似 超二級(jí)結(jié)構(gòu)的螺旋－轉(zhuǎn)角－螺旋的結(jié)合基序 。 ? DNA序列的對(duì)稱性說明與之結(jié)合的蛋白質(zhì)也應(yīng)具有一定的對(duì)稱性。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 ? 但操縱基因幷不完全對(duì)稱，左側(cè)比右側(cè)結(jié)合阻遏蛋白的能力更強(qiáng)。 ? 如圖：以 +11為對(duì)稱軸，每邊為兩段各 6 bp的對(duì)稱序列 TGTGTG和 AATTGT。 由于細(xì)胞內(nèi)的阻遏蛋白含量很少，采用啟動(dòng)子突變的方法可增加 lacI的表達(dá)量。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 圖注： CAPcAMP二聚體結(jié)合靶 DNA位點(diǎn) ,αCTD 與 CAP蛋白上的特異位點(diǎn)相互作用，增強(qiáng)了聚合酶與啟動(dòng)子之間的結(jié)合。結(jié)果表明不同DNA片段確實(shí)有不同遷移率，且 DNA彎曲越顯著電泳遷移率相差越大，據(jù)此估算出了 CAPcAMP結(jié)合后引起 DNA彎曲的程度是 900的彎曲，與 x射線衍射晶體學(xué)研究得出的約 1000彎曲基本吻合。 ? 然后使每一 DNA片段分別與 CAPcAMP結(jié)合，對(duì)形成的 DNA蛋白質(zhì)復(fù)合體進(jìn)行凝膠電泳，如果 CAP的結(jié)合確實(shí)導(dǎo)致 DNA彎曲，那么不同的DNA片段就會(huì)有不同的電泳遷移率。 2022 by the AAAS. ) 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 2022/2/14 ? H Wu等人通過電泳法檢測(cè)到 DNA彎曲現(xiàn)象，當(dāng)DNA片段彎曲后其電泳遷移率較慢，且彎曲部位越接近 DNA片段中部，遷移率就越慢。當(dāng) CAPcAMP與 DNA靶位點(diǎn)結(jié)合后引起 DNA片段產(chǎn)生了大約 1000的鏈彎曲，在 CAPcAMPDNA復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)圖像同樣能觀察到 DNA彎曲現(xiàn)象。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 ? 結(jié)合在激活子結(jié)合位點(diǎn)上的 CAPcAMP能夠協(xié)助 RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合，當(dāng) CAP和聚合酶與各自的 DNA靶位點(diǎn)結(jié)合后，兩者會(huì)發(fā)生直接的接觸，因此它們與 DNA的結(jié)合有協(xié)同效應(yīng)。 ? 主啟動(dòng)子命名為 P1，可選擇性啟動(dòng)子命名為 P2, CAPcAMP能降低 P2的轉(zhuǎn)錄起始，促進(jìn) P1。 (Robert F. Weaver. Molecular Biology (4th Edition) 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 CAP與 cAMP協(xié)同促進(jìn)形成開放啟動(dòng)子復(fù)合體 ? cAMP還有一種方式促進(jìn)乳糖操縱子轉(zhuǎn)錄。遺傳作圖發(fā)現(xiàn)突變位于 lac啟動(dòng)子上，表明 CAPCAMP復(fù)合體的結(jié)合位點(diǎn)在 lac啟動(dòng)子內(nèi)，又稱激活因子結(jié)合位點(diǎn)（ activatorbinding site)，位于啟動(dòng)子的上游 ,CAPCAMP與激活因子位點(diǎn)的結(jié)合有助于RNA聚合酶在啟動(dòng)子處形成開放啟動(dòng)子復(fù)合體(圖 )。 ? 降解物抑制的作用 是通過促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄正調(diào)節(jié)基因表達(dá)，這是一種積極的調(diào)節(jié)方式 ,這種現(xiàn)象稱為 葡萄糖效應(yīng) 或稱為 降解物抑制作用。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 如果培養(yǎng)基中葡萄糖含量下降， 腺苷酸環(huán)化酶活力就提高， cAMP合成增加， cAMP與CAP形成復(fù)合物幷與啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)乳糖操縱子的表達(dá) 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 ? lac操縱子正調(diào)控因子能感知葡萄糖的缺乏，通過激活 lac啟動(dòng)子做出應(yīng)答，使聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合而轉(zhuǎn)錄。 cAMPCAP是一個(gè)重要的正調(diào)節(jié)物質(zhì)， 可與操縱子上的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄 。能夠?qū)ζ咸烟菨舛茸兓龀鰬?yīng)答反應(yīng)的物質(zhì)是 環(huán)腺苷酸 (cyclicAMP, cAMP) 。 細(xì)胞能保持乳糖操縱子處于相對(duì)失活狀態(tài)， 這種選擇由葡萄糖的降解產(chǎn)物控制，將這種調(diào)控方式稱為 代謝阻遏 。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 3 乳糖操縱子的正調(diào)控 ? 葡萄糖存在時(shí)，即使培養(yǎng)基中加入乳糖、半乳糖、阿拉伯糖麥芽糖等誘導(dǎo)物，與其相對(duì)應(yīng)的操縱子也不啟動(dòng)產(chǎn)生代謝這些糖的酶， 因?yàn)槠咸烟鞘亲畛Ｓ玫奶荚?，?xì)菌所需要的能量主要從葡萄糖獲得。 ? 當(dāng)這些物質(zhì)在細(xì)菌生活環(huán)境中含量較高時(shí)，基因就自然被關(guān)閉，停止其合成。 ? 但當(dāng) 生存條件發(fā)生變化， 如葡萄糖缺乏而必須利用乳糖時(shí)，這些基因就被誘導(dǎo)開放。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 ? 由輔阻遏物參與引起的調(diào)節(jié)又稱為 可阻遏的調(diào)節(jié) ，既這類基因在 正常情況下是開啟的 ，處于正在合成蛋白質(zhì)或酶的狀態(tài)，由于一些特殊代謝終產(chǎn)物或化合物的積累將其關(guān)閉，阻遏了基因的表達(dá)，所以稱 可阻遏基因 。這 與誘導(dǎo)物的作用相反。指某些基因在誘導(dǎo)物作用下， 由原來的關(guān)閉狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚_放狀態(tài)，即在某些物質(zhì)誘導(dǎo)下使基因活化。 ? 有誘導(dǎo)物時(shí)， 誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合，促使后者空間構(gòu)象變化，使阻遏蛋白與操縱基因親和力下降而解離，最終， RNA聚合酶能夠進(jìn)入啟動(dòng)子區(qū)域，開啟了結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。 ? 這類小分子物質(zhì)間或是代謝途徑的底物或產(chǎn)物，同屬基因表達(dá)的調(diào)節(jié)物質(zhì)，稱為 效應(yīng)物。 ? 誘導(dǎo) 是基因表達(dá)的開關(guān)， 不同誘導(dǎo)物誘導(dǎo)效率有一定差異，但只影響轉(zhuǎn)錄和翻譯效率，不影響三種基因間的相互關(guān)系。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 ? 對(duì)乳糖操縱子的調(diào)節(jié)屬于一種協(xié)同調(diào)節(jié) (coordinate regulation)，所有受調(diào)節(jié)基因作為一個(gè)整體表達(dá)，或不表達(dá)。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 β半乳糖苷酶的誘導(dǎo)物與天然誘導(dǎo)物相類似 后者是一些不能被代謝的含硫乳糖類似物 如： 巰甲基硫代半乳糖苷 methylgalactoside TMG 異丙基硫代 βD半乳糖苷 (isopropylthioβDgalactoside， IPTG )， 及在酶活性分析中常用的生色底物 O硝基半乳糖苷 ONPG， 都是高效誘導(dǎo)物。 ? 一個(gè)大腸菌細(xì)胞有大約 10個(gè)分子阻遏蛋白。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 ? 阻遏蛋白上有二個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)是操縱基因結(jié)合位點(diǎn)，另一個(gè)是誘導(dǎo)物結(jié)合位點(diǎn)。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 ? 【 該系統(tǒng)中的誘導(dǎo)物不是乳糖本身，而是乳糖的同分異構(gòu)體 —異乳糖 ,因?yàn)槿樘沁M(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞后被轉(zhuǎn)化成了異乳糖 】 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 6 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 由圖可見， lacZYA基因的轉(zhuǎn)錄受 lacI基因編碼合成的調(diào)控蛋白的控制。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 ? Lactose operon調(diào)控機(jī)制： ? 當(dāng)培養(yǎng)基中沒有乳糖時(shí)，存在于操縱子上游的調(diào)節(jié)基因編碼表達(dá)的阻遏蛋白結(jié)合到操縱子中的操縱基因上，阻止了結(jié)構(gòu)基因的表達(dá) , ? lacZ基因被調(diào)節(jié)基因編碼表達(dá)的阻遏蛋白所阻遏，此時(shí)，在細(xì)胞中 只有幾個(gè) β半乳糖苷酶分子。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 ? 細(xì)菌獲得的這一能力的原因是 在乳糖的誘導(dǎo)作用下開啟了乳糖操縱子，表達(dá)了與代謝乳糖相關(guān)的一系列酶所致。 圖 : 大腸桿菌乳糖操縱子各功能區(qū)組織排列 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控 ? 大腸桿菌在有葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，不能代謝乳糖，因?yàn)槿鄙偃樘谴x的酶。 2022/2/14 分子生物學(xué) 原核基因表達(dá)調(diào)控