原核表達(dá)載體(參考版)
2025-08-08 03:30本頁面
【正文】 ④Western blot分析（還沒教） ⑤重組蛋白的親和純化。分離上清和沉淀，上清直接加等體積2 Loading buffer，沉淀用PBS重懸后，加等體積2Loading buffer，沸水煮5 min變性。vii. 收集沉淀，加適量破碎液重懸細(xì)胞，300 w超聲波破碎20 min，工作10 s停10 s。v. 去上清，PBS清洗沉淀。iii. 將過夜培養(yǎng)的菌液100 μl加入到10 mL LB培養(yǎng)基中(1: 100)，200 r/min振蕩培養(yǎng)3 h左右至OD600=。 ③檢測重組蛋白可溶性（好像做多克隆抗體不用檢測蛋白可溶性？） i. 將重組菌在含對應(yīng)抗生素的LB平板上劃線培養(yǎng)過夜。加2Loading buffer后沸水變性5 min。在剩余9 mL菌液中加100 mmol/L IPTG 54 mmol/L，此時記為0 h。iii. 將過夜培養(yǎng)的菌液100 μl加入到10 mL LB培養(yǎng)基中(1: 100)，200 r/min振蕩培養(yǎng)3 h左右至OD600=。 ②IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)（這個不確定）i. 將重組菌在含對應(yīng)抗生素的LB平板上劃線培養(yǎng)過夜。⑧菌種保存取500μl重組菌液加入等體積50%的無菌甘油(終濃度達(dá)到25%)，液氮速凍，80℃保存。 酶切反應(yīng)體系、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間根據(jù)內(nèi)切酶的種類確定設(shè)計。 ⑤重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli 宿主菌（根據(jù)表達(dá)載體確定）（熱擊法） DH52（200ul）或（100ul） 【非連接載體加2ul】 【加入后離火遠(yuǎn)點輕輕用手撥】↓冰上放置20min ↓42℃水浴熱擊90s ↓立即放置冰上2min（勿震蕩） ↓于超凈工作臺加800ul LB培養(yǎng)液 ↓37℃，150rpm預(yù)培養(yǎng)50min ↓6000rpm離心1min，吸除800ul上清；剩余液體用來懸浮沉淀 ↓涂布LB+Amp平板上，37℃倒置培養(yǎng)12h（于超凈工作臺吹干液體）。離心管中的液體即為回收的目的基因片段，可立即使用或保存于20℃?zhèn)溆?。vi. 取下吸附柱，倒掉收集管中的廢液，室溫12000 rpm離心1 min。iv. 取下吸附柱，倒掉收集管中的廢液，加入
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