【導(dǎo)讀】按照相對(duì)分子量的大小，生物配體可分為兩大類：一類為大分子配體，子配體，包括氨基酸、羧酸、卟啉等。氨基酸是指含有氨基的羧酸，為蛋白質(zhì)的基本組成單位。按照軟硬酸堿理論，氨基酸具有堿性較強(qiáng)的氨基及堿性較弱的羧基，故氨基酸具有很強(qiáng)的配位能力，能與大多數(shù)過(guò)渡及稀土元素形成配合物?；幔呆人岱肿又笑?碳原子的一個(gè)氫原子被氨基取代而成的化合物。式可用下式表示。式中R為α-氨基酸的側(cè)鏈，方框內(nèi)的基團(tuán)為各種氨基酸的共。蛋白質(zhì)是動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞中最重要的有機(jī)物質(zhì)之一。一般蛋白質(zhì)含氮在15%~%，平均值為16%，因此只要測(cè)定樣品。實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明蛋白質(zhì)是由各種氨基酸。蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指肽鏈的數(shù)目、肽鏈中氨基酸。它們對(duì)維持蛋白質(zhì)分。子的立體結(jié)構(gòu)和行使蛋白質(zhì)功能都起著重要作用。肽鏈中的氨基酸已不是原來(lái)完整的分子，而是具。二硫鍵，它由兩個(gè)半胱氨酸殘基的巰基脫氫氧化連接而成。

　　

【正文】 l 等人詳細(xì)研究了 M(L)(Aa)(M=Pd2+、 Pt2+， L=bipy、 phen， Aa－ 氨基酸根 )單核混配型配合物及雙核混配配合物 M2(bipy)2(L)(L=烷撐基雙甘氨酸根 )對(duì)老鼠肝臟細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的抑制活性。表 和表 分別給出了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。雙核配合物的結(jié)構(gòu)見圖 。 表 M(L)(Aa)型配合物對(duì)老鼠肝細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的抑制活性 Aa－ ID50(mmol) Pt(bipy)(Aa) Pd(bipy)(Aa) Pt(phen)(Aa) Pd(phen)(Aa) alanine leucine methionine phenylalanine tryptophan glycine tyrosine glutamine glutamate lysine histidine Chloride － － － － － － － － － － － － － － － － － － 注：配體從上至下分別為：丙氨酸根、亮氨酸根、甲硫氨酸根、苯丙氨酸根、色氨酸根、甘氨酸根、酪氨酸根、谷氨酸根、谷氨酰胺、賴氨酸根、組氨酸根、氯 35 離子 表 中數(shù)據(jù)表明，無(wú)論 bipy 還是 phen 體系，對(duì)應(yīng)的 Pd(II)配合物總體上說(shuō)均比 Pt(II)配合物有較高的活性。 表 的結(jié)果顯示，雙核配合物，隨著脂肪鏈的增加， Pt(II)配合物的活性明顯增強(qiáng)，辛烷（ X=8）比丁烷鏈 (X=4)活性高 倍，這可能在于長(zhǎng)鏈會(huì)使兩個(gè)端基更靈活地與細(xì)胞結(jié)合。盡管對(duì)于 Pd(II)配合物， X＝ 8 時(shí)沒有測(cè)出 ID50值，但 X=6 時(shí)，其活性也確實(shí)好于相應(yīng) Pt(II)配合物。 表 雙核配合物對(duì)老鼠肝細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的抑制活性 ID50(mmol) (CH2)X M= Pt(II) M= Pd(II) Butane(X=4) Hexane(X=6) Octane(X=8) － － NNMONHONNMONHO( C H 2 ) x 圖 31 雙核 Pd(II)、 Pt(II)配合物結(jié)構(gòu)示意圖 Quiroga 等對(duì) [M(TSCN)( μ－ Cl)]2 和 [M(TSCN － NMe2)]4 型配合物（ M=Pd2+,Pt2+）對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的活性進(jìn)行了詳細(xì)研究，表 列出了其中兩組配合物的活性結(jié)果。配合物的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式見圖 。 36 表 Pd2+、 Pt2+配合物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的半數(shù)殺傷濃度 IC50（μ mol） Complex PAMras GLIOMA112 HL60 U937 HeLa 3T3 PAM TSCN Pd2+ Pt2+ CisDDP 65 47 21 157 75 67 59 120 57 22 30 7 76 38 45 22 78 58 45 7 97 35 88 72 124 164 H 2 NCNNSMCl2CHC H ( C H 3 ) 2 圖 32 配合物 [M(TSCN)(μCl)]2(M=Pd2+、 Pt2+)結(jié)構(gòu)示意圖 表 中結(jié)果顯示，兩種 Pd2+,Pt2+配合物，對(duì) 7 種腫瘤細(xì)胞的殺傷活性普遍高于有機(jī)配體 TSCN。對(duì) HL60、 L93 3T3 和 PAM4 種腫瘤細(xì)胞的活性順序?yàn)镻d2+Pt2+.對(duì) PAM－ ras、 GLIOMA11 HeLa、 3T3 和 PAM 的活性，無(wú)論 Pd2+還是 Pt2+配合物，均好于 CisDDP。 三、釕配合物抗癌活性 大量研究表明，釕配合物具有低毒性、易吸收、排泄快等優(yōu)點(diǎn)，是最有前途的抗癌藥物之一。歐盟于 1997 年成立了釕抗癌藥物研究和發(fā)展工作組，進(jìn)一步加強(qiáng)了釕抗癌藥物的研究，目前已有多個(gè)釕金屬配合物進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段。其中，以 DMSO 為配體的釕（ Ⅱ）、釕（ Ⅲ ）配合物作為抗腫瘤藥物的研究取得了令人滿 意的效果，對(duì)其中幾個(gè)化合物進(jìn)行了相應(yīng)得動(dòng)物模型試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn) [TransRu (DMSO)(Im)(Cl4)] Im （結(jié)構(gòu)圖 33）具有很好的抗癌活性， 1999 年在荷蘭的癌癥學(xué)會(huì)進(jìn)入一期臨床階段， 2020 年進(jìn)入二期臨床階段。 37 NH NR uC lC lC lC lSOC H 3C H 3N HH +N 圖 33 [TransRu (DMSO)(Im)(Cl4)] Im 的結(jié)構(gòu) 四、其它金屬配合物 cisDDP 作為臨床藥物的使用，使金屬配合物的研究方興未艾?？茖W(xué)家可以有目的的選擇配位結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的金屬配合物作為研 究對(duì)象。除上述提到的鉑、鈀、錫、鍺等，對(duì)常見的，如銅、鈷、鎳、鋅乃至釕、鍺甚至稀土等配合物無(wú)所不入。這些化合物不僅結(jié)構(gòu)多樣，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制能力，并具有規(guī)律性，為開發(fā)研制新型無(wú)機(jī)藥物分子提供了有價(jià)值的信息。 38 第三節(jié) 抗腫瘤配合物的體外篩選 抗腫瘤藥物篩選是抗腫瘤藥物研究工作中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié) , 建立合理的篩選體系 , 提高篩選質(zhì)量 , 發(fā)現(xiàn)新的抗癌藥物 , 是 90 年代腫瘤藥理研究的一項(xiàng)重大課題。 80 年代中期以前 ,普遍采用的篩選方法是以體內(nèi)小鼠白血病 / 淋巴瘤 模型 P388 和 L1210 為基礎(chǔ)的 ,所有化合物在進(jìn)一步的臨床研究之前必須通過(guò)這種小鼠腫瘤模型的篩選。即小鼠白血病 P388 和 L1210 作為第一輪初篩 ,能通過(guò)第一輪初篩的化合物才能被允許進(jìn)入第二輪篩選。這種方法有一個(gè)很明顯的缺陷就是一些在臨床上有活性的藥物將被篩選掉 ,無(wú)法保證所有具有抗腫瘤作用的藥物都能通過(guò)篩選。鑒于以前的篩選方法存在較大的缺陷 ,1985 年之后以 美國(guó)NCI 為首的一些研究單位普遍開始采用針對(duì)疾病的篩選方法來(lái)代替針對(duì)化合物的篩選方法 ,即放棄體內(nèi)小鼠篩選 ,代之為體外代表各種常見實(shí)體瘤的人類腫瘤 細(xì)胞株篩選。 體外篩選方法主要有： MTT 比色分析法、 SRB 法、酸性磷酸酶法 ATP 生物發(fā)光法等方法，其中 MTT 法是目前各實(shí)驗(yàn)室最常用的體外抗腫瘤藥物篩選法 。根據(jù)活的增殖細(xì)胞能代謝 MTT 使 MTT 開環(huán) ,形成一種藍(lán)紫色的化合物甲 臢 沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周圍 ,形的甲 臢 的量與細(xì)胞增殖程度成正比例關(guān)系 ,而建立的MTT 比色分析法。該法具有不涉及使用放射性元素 ,所用試劑少 ,儀器簡(jiǎn)單 ,耗時(shí)少 ,出結(jié)果快 ,結(jié)果與同位素?fù)饺敕ㄒ恢碌葍?yōu)點(diǎn) ,適用于大量抗癌藥物的篩選 ,抗癌作用機(jī)理的探討研究以及指導(dǎo)臨床合理用藥。 一、 腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性 形態(tài)和 性狀 培養(yǎng)中癌細(xì)胞無(wú)光學(xué)顯微鏡下特異形態(tài)，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞鏡下觀察比二倍體細(xì)胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯，核糖體顆粒豐富。電鏡觀察癌細(xì)胞表面的微絨毛多而細(xì)密，微絲走行不如正常細(xì)胞規(guī)則，可能與腫瘤細(xì)胞具有不定向運(yùn)動(dòng)和錨著不依賴性有關(guān)。 生長(zhǎng)增殖 腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)具有不受控增殖性，在體外培養(yǎng)中仍如此。正常二倍體細(xì)胞在體外培養(yǎng)中不加血清不能增殖，是因血清中含有很細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的因子，而癌 39 細(xì)胞在低血清中（ 2％～ 5％）仍能生長(zhǎng)。已證明腫瘤細(xì)胞有自泌或內(nèi)泌性產(chǎn)生促增殖因子能力。正常細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后，出現(xiàn)能在低血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的現(xiàn) 象，已成為檢測(cè)細(xì)胞惡變的一個(gè)指標(biāo)。癌細(xì)胞或培養(yǎng)中發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后的單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，形成集落（克隆）的能力比正常細(xì)胞強(qiáng)。另外癌細(xì)胞增殖數(shù)量增多擴(kuò)展時(shí)，接觸抑制消除，細(xì)胞能相互重疊向三維空間發(fā)展，形成堆積物。 永生性 永生性也稱不死性。在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為細(xì)胞可無(wú)限傳代而不凋亡（ Apoptosis）。體外培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株都表現(xiàn)有這種性狀，體內(nèi)腫瘤細(xì)胞是否如此尚無(wú)直接證明。因惡性腫瘤終將殺死宿主并同歸于盡，從而難以證明這一性狀的存在。體外腫癌細(xì)胞的永生性是否能反證它在體內(nèi)時(shí)同樣如此？也尚難肯定。從 近年建立細(xì)胞系或株的過(guò)程說(shuō)明，如果永生性是體內(nèi)腫瘤細(xì)胞所固有的，腫瘤細(xì)胞應(yīng)易于培養(yǎng)。事實(shí)上，多數(shù)腫瘤細(xì)胞初代培養(yǎng)時(shí)并不那么容易。生長(zhǎng)增殖并不旺盛；經(jīng)過(guò)純化成單一化瘤細(xì)胞后，也大多增殖若干代后，便出現(xiàn)類似二倍體細(xì)胞培養(yǎng)中的停滯期。過(guò)此階段后才獲得永生性，順利傳代生長(zhǎng)下去。從而說(shuō)明體外腫瘤細(xì)胞的永生性有可能是體外培養(yǎng)后獲得的。從一些具有永生性而無(wú)惡性性的細(xì)胞系，如 NIH3T Rat－ 10T1/2 等細(xì)胞證明，永生性和惡性（包括浸潤(rùn)性）是兩種性狀，受不同基因調(diào)控，但卻有相關(guān)性?？赡苡郎允羌?xì)胞惡變的階段。至少 在體外是如此。 浸潤(rùn)性 浸潤(rùn)性是腫瘤細(xì)胞擴(kuò)張性增殖行為，培養(yǎng)癌細(xì)胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養(yǎng)時(shí)，能浸潤(rùn)入其它組織細(xì)胞中，并有穿透人工隔膜生長(zhǎng)的能力。 異質(zhì)性 所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態(tài)等性狀不同的細(xì)胞組成。異質(zhì)性構(gòu)成同一腫瘤內(nèi)細(xì)胞的活力有差別的瘤組織；處于瘤體周邊區(qū)的細(xì)胞獲得血液供應(yīng)多，增殖旺盛，中心區(qū)有的細(xì)胞衰老退化，有的處于周期阻滯狀態(tài)，那些呈活躍增殖狀態(tài)的細(xì)胞稱干細(xì)胞（ Stem Cells）、只有這些干細(xì)胞才是支持腫瘤生長(zhǎng)的成分。腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)易于生 長(zhǎng)增殖；把干細(xì)胞分離出來(lái)的培養(yǎng)方法稱干細(xì)胞培養(yǎng)。 細(xì)胞遺傳 40 大多數(shù)腫瘤細(xì)胞有遺傳學(xué)改變，如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。腫瘤細(xì)胞群常由多個(gè)細(xì)胞群組成，有干細(xì)胞系和數(shù)個(gè)亞系，并不斷進(jìn)行著適應(yīng)性演變。 其它 腫瘤細(xì)胞在體外不易生長(zhǎng)的原因可能由于：①依賴性：腫瘤細(xì)胞雖有較強(qiáng)克隆生長(zhǎng)力，但仍有一定的群體性或與其它細(xì)胞相依存關(guān)系。一是腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互依存，二是腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)成纖維細(xì)胞的依賴。體外分散培養(yǎng)和排除成纖維細(xì)胞后也會(huì)同時(shí)消除或減弱這些依存關(guān)系，可能影響癌細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的活性；②腫瘤細(xì)胞的自 泌也會(huì)因分散培養(yǎng)而被稀釋，達(dá)不到腫瘤生長(zhǎng)的需求，降低腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖力；③并非所有腫瘤細(xì)胞都有強(qiáng)的生長(zhǎng)活力和長(zhǎng)的 Life Span，只有干細(xì)胞才有強(qiáng)的增殖生長(zhǎng)能力，但這些細(xì)胞數(shù)量很少；④離體培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞可能需求與體內(nèi)相似的特殊生存條件。 二、 腫瘤 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 、 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長(zhǎng)，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法，同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過(guò)程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需 經(jīng)消化后才能分瓶。 、 傳代前準(zhǔn)備 (1).把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、 PBS 液和胰蛋白酶的瓶子從冰箱中取出使之溫度升至室溫。 (2).正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。 (3).點(diǎn)燃酒精燈：注意火焰不能太小。 (4).從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞：注意取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺(tái)面，再在鏡下觀察細(xì)胞。 、 胰蛋白酶消化 (1).加入消化液：倒出舊培養(yǎng)液，用 PBS 清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細(xì)胞最好，最佳消化溫 度是 37℃。 (2). 顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間 41 不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度。 觀察消化也可以用肉眼，當(dāng)見到瓶底發(fā)白并出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時(shí)終止消化。一般室溫消化時(shí)間約為 1— 3 分鐘。 (3).加入培養(yǎng)液終止消化。 、 吹打分散細(xì)胞 (1).吹打制懸：用移液器將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。 (2).吸細(xì)胞懸液入離心管：將細(xì)胞懸液吸入 50ml 離心管中。 (3).平衡離心：平衡后將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，以 1000 轉(zhuǎn) /分鐘離心 5 分鐘。 (4).棄上清液，加入 新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入定量培養(yǎng)液，用移液器輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。 、 分裝稀釋細(xì)胞 將細(xì)胞懸液吸出按 1： 3～ 5 分裝至新培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋，做好標(biāo)記。 、 繼續(xù)培養(yǎng) 用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入 CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞約 2 小時(shí)后開始貼附在瓶壁上。 、注意事項(xiàng) (1).嚴(yán)格的無(wú)菌操作 (2).適度消化：消化的時(shí)間受消化液的種類、配制時(shí)間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過(guò)程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片 浮起的跡象就要立即終止消化 三、 MTT 法測(cè)細(xì)胞相對(duì)活力以及檢測(cè)抗腫瘤藥物的抑制細(xì)胞增殖活性 1983 年， Mosmann 等根據(jù)細(xì)胞能量代謝水平與 DNA 合成水平相平行的原理，建立了四甲基偶氮唑鹽 (MTT) 比色法。由于黃色的 MTT 能被活細(xì)胞線粒體脫氫酶 (如琥珀酸脫氫酶和心肌黃酶 )還原成藍(lán)紫色的甲臢 (Formazan)，死細(xì)胞則無(wú)這種能力，從而可用比色法推測(cè)細(xì)胞的存活和增殖程度。該方法