【正文】 進(jìn)行有關(guān)的數(shù)據(jù)分析。第二節(jié) 丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法。在這種支持介質(zhì)上可根據(jù)被分離物質(zhì)分子大小和分子電荷多少來分離。一、聚丙烯酰胺凝膠優(yōu)點(diǎn)聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和N，N39。甲叉雙丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝膠有格子是帶有酰胺側(cè)鏈的碳碳聚合物，沒有或很少帶有離子的側(cè)基，因而電滲作用比較小，不易和樣品相互作用。由于聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的物質(zhì)，在聚合前可調(diào)節(jié)單體的濃度比，形成不同程度交鏈結(jié)構(gòu)，其空隙度可在一個較廣的范圍內(nèi)變化，可以根據(jù)要分離物質(zhì)分子的大小，選擇合適的凝膠成分，使之既有適宜的空隙度，又有比較好的機(jī)械性質(zhì)。一 般說來，%的凝膠，機(jī)械性能適用于分離分子量范圍1萬至100萬物質(zhì)，1萬以下的蛋白質(zhì)則采用含丙烯酰胺1530%的凝膠，而分子量特別大的可采用含丙烯酰胺4%的凝膠，大孔膠易碎，小孔膠則難從管中取出，因此當(dāng)丙烯酰胺的濃度增加時可以減少丙烯酰胺，以改進(jìn)凝膠的機(jī)械性能。在一定濃度范圍聚丙烯酰胺對熱穩(wěn)定。凝膠無色透明，易觀察，可用檢測儀直接測定。丙烯酰胺是比較純的化合物，可以精制，減少污染。合成聚丙烯酰胺凝膠的原料是丙烯酰胺和丙烯酰胺。丙烯酰胺稱單體，丙烯酰胺稱交聯(lián)劑，在水溶液中，單體和交聯(lián)劑通過自由基引發(fā)的聚合反應(yīng)形成凝膠。二、催化劑催化聚丙烯酰胺凝膠的形成在聚丙烯酰胺凝膠形成的反應(yīng)過程中，需要有催化劑參加，催化劑包括引發(fā)劑和加速劑兩部分。引發(fā)劑在凝膠形成中提供始自由基，通過自由基的傳遞，使丙烯酰胺成為自由基，發(fā)動聚合反應(yīng)，加速劑則可加快引發(fā)劑釋放自由基的速度。常用的引發(fā)劑和加速劑的配伍如下表： 表32 聚合反應(yīng)催化劑配伍引 發(fā) 劑 加 速 劑(NH4)2S2O8 TEMED(NH4)2S2O8DMAPN核 黃 素 TEMED注：(NH4)2S2O8：過硫酸銨 TEMED：N，N，N，N39。四甲基乙二胺 DMAPN：β－二甲基胺基丙晴 　　用過硫酸銨引發(fā)的反應(yīng)稱化學(xué)聚合反應(yīng)；用核黃素引發(fā)，需要強(qiáng)光照射反應(yīng)液，稱光聚合反應(yīng)。聚丙烯酰胺聚合反應(yīng)可受下列因素影響： 大氣中氧能淬滅自由基，使聚合反應(yīng)終止，所以在聚合過程中要使反應(yīng)液與空氣隔絕。某些材料如有機(jī)玻璃，能抑制聚合反應(yīng)。某些化學(xué)藥物可以減慢反應(yīng)速度，如赤血鹽。溫度高聚合快，溫度低聚合慢。以上幾點(diǎn)在制備凝膠時必須加以注意。凝膠的篩孔，機(jī)械強(qiáng)度及透明度等很大程度上由凝膠的濃度和交聯(lián)劑決定。每100 ml凝膠溶液中含有單體和交聯(lián)劑的總克數(shù)稱凝膠濃度，常用T %表達(dá)；凝膠溶液中交聯(lián)劑占單體和交聯(lián)體總量的百分?jǐn)?shù)稱為交聯(lián)度，常用C %表示?！　〗宦?lián)度過高，膠不透明并缺乏彈性；交聯(lián)度過低，凝膠呈糊狀。聚丙烯酰胺凝膠具有較高的粘度，它不防止對流減低擴(kuò)散的能力，而且因?yàn)樗哂腥瓤臻g網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，某分子通過這種網(wǎng)孔的能力將取決于凝膠孔隙和分離物質(zhì)顆粒的大小和形狀，這是凝膠的分子篩作用。由于這種分子篩作用，這里的凝膠并不僅是單純的支持物，因此，在電泳過程中除了注意電泳的基本原理以外，還必須注意與凝膠本身有關(guān)的各種性質(zhì)（網(wǎng)孔的大小和形狀等）。三、不同濃度丙烯酰胺凝膠分離范圍有人測定了總濃度（T）為20%的丙烯酰胺液，在六種不同比例的雙丙烯酰胺存在 下，聚合后的網(wǎng)孔大小，發(fā)現(xiàn)孔徑與總濃度有關(guān)，總濃度愈大，孔徑相應(yīng)變小，機(jī)械強(qiáng)度增強(qiáng)，與總濃度不變時，甲叉雙丙烯酰胺（Bis)的濃度在5%時孔徑最小，高于或低于此值時，聚合體孔徑都相對變大，凝膠孔徑在凝膠電泳中是一個重要的參數(shù)，它往往決定了電泳的分離效果。經(jīng)過不斷的實(shí)踐，得到了如表3所示的經(jīng)驗(yàn)值，在一般情況下，%濃度的凝膠，所得電泳結(jié)果往往是滿意的，因此稱由此濃度組成的凝膠為“標(biāo)準(zhǔn)凝膠”。對那些用于重要研究的凝膠，最好是通過采用10%的一系列凝膠濃度梯進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，以選出最適凝膠濃度。表33 不同分子量范圍的蛋白質(zhì)和核酸在凝膠電泳中所選用的凝膠濃度百分率物 質(zhì)分子量范圍適用的凝膠濃度（%）蛋白質(zhì)10 2030 14104　 1520 41041105 1015 15105510 510525核酸104 1020 1041055101052106　　聚丙烯酰胺凝膠電泳可分為連續(xù)的和不連續(xù)的兩類，前者指整個電泳系統(tǒng)中所用緩沖 液，pH值和凝膠網(wǎng)孔都是相同的，后者是指在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩 沖液，pH值和孔徑，不連續(xù)電泳能使稀的樣品在電泳過程中濃縮成層，從而提高分辨 能力。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小 和形狀等因素。如果加入一種試劑使電荷因素消除，那電泳遷移率就取決于分子的大 小，就可以用電泳技術(shù)測定蛋白質(zhì)的分子量。1967年，Shapiro等發(fā)現(xiàn)陰離子去污劑 十二烷基硫酸鈉（SDS）具有這種作用。當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入足夠量SDS和巰基乙 醇，SDS可使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原。由于十二烷基硫酸根帶負(fù)電，使各種蛋白 質(zhì)—SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，它的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原的電荷量，因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間原有的電荷差別，SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還可引起構(gòu)象改 變，蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物形成近似“雪茄煙”形的長橢圓棒，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物 的短軸長度都不一樣，約為18A，這樣的蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，在凝膠中的遷移率，不 再受蛋白質(zhì)原的電荷和形狀的影響，而取決于分子量的大小，因而SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可以用于測定蛋白質(zhì)的分子量。第三節(jié) 醋酸纖維素薄膜電泳醋酸纖維素薄膜是由醋酸纖維素加工制成的。一、醋酸纖維素薄膜優(yōu)點(diǎn)醋酸纖維素薄膜作為是電泳支持體有以下優(yōu)點(diǎn)：① 電泳后區(qū)帶界限清晰；② 通電時間較短（20 min至1 h）；③ 它對各種蛋白質(zhì)（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都幾乎完全不吸附，因此無拖尾現(xiàn)象；④ 對染料也沒有吸附，因此不結(jié)合的染料能完全洗掉，無樣品處幾乎完全 無色。它的電滲作用雖高但很均一，不影響樣品的分離效果，由于醋酸纖維素薄膜吸水量較低，因此必需在密閉的容器中進(jìn)行電泳，并使用較低有電流避免蒸發(fā)。二、醋酸纖維素薄膜電泳應(yīng)用醋酸纖維素薄膜電泳已經(jīng)廣泛用于血清蛋白，血紅蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，類固醇及同工酶等的分離分析中，盡管它的分辨力比聚丙酰胺凝膠電泳低，但它具有簡單，快速等優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)樣品理化性質(zhì)，從提高電泳速度和分辨力出發(fā)選擇緩沖液的種類，pH和離子強(qiáng)度。選擇好的緩沖液最好是揮發(fā)性強(qiáng)，對顯色或紫外光等觀察區(qū)帶沒有影響，若樣品含鹽量較高時，宜采用含鹽緩沖液。；。電泳時先將濾膜剪成一定長度和寬度的紙條。在欲點(diǎn)樣的位置用鉛筆做上記號，點(diǎn)上樣品，在一定的電壓，電流下電泳一定時間，取下濾膜，進(jìn)行染色。不同物質(zhì)需采用不同的顯色方法，如核苷酸等物質(zhì)可在紫外分析燈下觀察定位，但許多物質(zhì)必須經(jīng)染色劑顯色。醋酸纖維素薄膜電泳染色后區(qū)帶可剪下，溶于一定的溶劑中進(jìn)行光密度測定。，然后直接用光密度計測定。它的缺點(diǎn)是厚度小，樣品用量很小，不適于制備。第四節(jié) 等電聚焦等電聚焦就是在電泳槽中放入載體兩性電解質(zhì)，當(dāng)通以直流電時，兩性電解質(zhì)即形成一個由陽極到陰極逐步增加的pH梯度，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)放進(jìn)此體系時，不同的蛋白質(zhì)即移動到或聚焦于與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H位置上。一、等電聚焦的優(yōu)缺點(diǎn)等電聚焦的優(yōu)點(diǎn)是：有很高的分辨率，；一般電泳由于受擴(kuò)散作用的影響，隨著時間和所走的距離加長，區(qū)帶越走越寬，而電聚焦能抵消擴(kuò)散作用，使區(qū)帶越走越窄；由于這種電聚焦作用，不管樣品加在什么部位，都可聚焦到其電點(diǎn)，很稀的樣品也可進(jìn)行分離；可直接測出蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。等電聚焦的缺點(diǎn)是：① 電聚焦要求用無鹽溶液，而在無鹽溶液中蛋白質(zhì)可能發(fā)生沉淀；② 樣品中的成分必需停留于其等電點(diǎn)，不適用在等電點(diǎn)不溶或發(fā)生變性的蛋白質(zhì)。　　等電聚焦技術(shù)要求有穩(wěn)定的pH梯度，要求防止對流和防止已分離區(qū)帶再混合的措施，其辦法：密度梯度，聚丙烯酰胺凝膠和區(qū)帶對流聚焦，其中以第一種方法為常用。二、基本原理 （一）人工pH梯度在分離蛋白質(zhì)時常用一個直立的性，以蔗糖密度梯度防止對流。當(dāng)兩個不同pH的緩沖液互相擴(kuò)散時，在其混合區(qū)間即形成pH梯度，稱為“人工pH梯度”。因?yàn)榫彌_液是電解質(zhì)，在電場中的它的離子移動會引起pH梯度的改變，所以不穩(wěn)定。（二）天然pH梯度這種梯度是由電流本身所引起并保持的，比較穩(wěn)定，其形成過程是，當(dāng)電解硫酸鈉的稀溶液時，在陽極聚焦硫酸而在陰極聚焦氫氧化鈉。若將一些兩性電解質(zhì)放入槽中，則它們在陽極的酸性介質(zhì)中就會得到質(zhì)子而帶正電，在陰極的堿性介質(zhì)中則失掉質(zhì)子而帶負(fù)電，這樣就會受其附近的電極所排斥而向相反方向移動。設(shè)其中有一個酸性最強(qiáng)的兩性電解質(zhì)（甲），當(dāng)它由陰極逐漸接近陽極的硫酸時，就會失去電荷而停止運(yùn)動，（甲）所在的位置就是它的等電點(diǎn)，另有一個等電點(diǎn)稍高于（甲）的物質(zhì)（乙)，當(dāng)向陽極運(yùn)動靠近（甲）時，它不能超過（甲），因?yàn)槟抢锏陀谒牡入婞c(diǎn)。于是（乙)將帶正電荷而向陰極移動，它只能排要（甲）的陰極側(cè)。假如有很多兩性電解質(zhì)，它們就會按照等電點(diǎn)由低到高的順序依次排列，形成一個由陽極向陰極逐步升高的平穩(wěn)的pH梯度，此梯度的進(jìn)程取決于兩性電解質(zhì)的pH值，濃度和緩沖性質(zhì)。防止對流的情況下，只要電流穩(wěn)定，這個pH梯度將保持不變。（三）兩性電解質(zhì)互相分離的條件上述經(jīng)驗(yàn)甲乙兩物質(zhì)形成兩個相鄰的不同pH的等電點(diǎn)層，因?yàn)樵谒鼈冎虚g不能形成純水層，所以它們不是完全分離開的，中間部分互相擴(kuò)散，互相粘連。要使兩物質(zhì)完全分開，中間必須有一個介于其間pH值的物質(zhì)，例如，當(dāng)甲乙兩物質(zhì)的pH值正好一個在7以下，一個在7以上，即可以分開，因?yàn)橹虚g形成了純水層（pH=7)，這時水是作為一個兩性電解質(zhì)而存在。（四）蛋白質(zhì)的電聚焦分離蛋白質(zhì)及多肽是兩性電解質(zhì)，它們比氨基酸更適于電聚焦，因?yàn)樗鼈冊诘入婞c(diǎn)附近仍有電荷而能進(jìn)行電遷移，大部分中性氨基酸在接近等電點(diǎn)時就失去電荷而停止運(yùn)動，不能過到真正的等電點(diǎn)。但在沒有第三種居間的兩性電解質(zhì)存在時也不能將兩種蛋白質(zhì)完全分開，必須有很多不同pH值的是電解質(zhì)（載體兩性電解質(zhì)）才能解決這個問題。三、載體兩性電解質(zhì) （一）載體兩性電解質(zhì)必需具備的條件在等電點(diǎn)處必需有足夠的緩沖能力，以便能控制pH梯度，而不致被樣品蛋白質(zhì)或其他兩性物質(zhì)的緩沖能力改變pH梯度的進(jìn)程。在等電點(diǎn)必需的足夠高電導(dǎo)，以便使一定的電流通過，而且要求具備不同pH值的載體有相同的電導(dǎo)系數(shù)，使整個體系中的電導(dǎo)均勻，如果有局部電導(dǎo)過小，就會產(chǎn)生極大的電位降，從而其他部分電壓就會太小，以致不能保持梯度，也不能使應(yīng)聚焦的成分進(jìn)行電遷移，達(dá)到聚焦。分子量要小，便于與被分離的高分子物質(zhì)用透析或凝膠過濾法分開?；瘜W(xué)組成應(yīng)不同于被分離物質(zhì)，不干擾測定。應(yīng)不與分離物質(zhì)反應(yīng)或使之變性?？偲饋碚f，當(dāng)一個兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)介于兩個很近的pK值之間時，它在等電點(diǎn)的解離度大，緩沖能力強(qiáng)，而且電導(dǎo)系數(shù)高，這就是好的載體兩性電解質(zhì)。（二）理想的載體兩性電解質(zhì)的合成　　用具有幾個pH值很相近的多乙烯多胺（如五乙烯六胺）為原料，與不飽和酸（如丙烯酸）發(fā)生加合反應(yīng)：加合反應(yīng)優(yōu)先加在α、β飽和酸的β碳原子上，調(diào)節(jié)胺和酸的比例可以加上一個或多個羧基，這種合成方法與一般有機(jī)會合成不同，有機(jī)合成一般要求合成的產(chǎn)物愈純愈好，而這里要求合成出的產(chǎn)物愈復(fù)雜愈好，要有多異構(gòu)物和同系物，以保證的很多具有不同而又互相接近的pK值和pI值，從而得到平滑的pH梯度。載體兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)在pH310的范圍，分子量在3001000之間，它們的緩沖能力等于或優(yōu)于組氨酸，電導(dǎo)性能良好，可以使電場強(qiáng)度分布較均勻，它們的水溶性良好，在1%水溶液中的紫外吸收值（260 nm）很低。第五節(jié) 密度梯度等電點(diǎn)聚焦 一、密度梯度密度梯度是用以防止對流保持pH梯度，避免已分離物質(zhì)再混合的重要措施則由重溶液和輕溶液以梯度混合形成。用做密度梯度的溶質(zhì)應(yīng)具有以下條件：溶解度高，粘度低；密度大， g/cm，不與樣品蛋白質(zhì)起反應(yīng)，不解離。最常用的是蔗糖（分析純），它對蛋白質(zhì)不僅無害還有保護(hù)作用。重溶液含蔗糖50%（w/v)， g/cm，濃度太高則粘度過大適用。蔗糖在高pH值時會分解，影響pH梯度及pI值測定，這種情況下可改用甘油，也可用甘露醇，山梨醇，右旋糖酐等。二、pH梯度的選擇 　　在測定未知蛋白時，可先采用pH310的載體，經(jīng)初步測定后改用較窄的以提高分辨率，在使用pH7以上或以下范圍時，因缺少中性載體，在聚焦過程中載體與電極之間在pH7部位就會形成純水區(qū)帶，純水的電導(dǎo)極低，必須避免此現(xiàn)象。在用pH低于3的范圍時，可加有機(jī)酸如一氯醋酸，二氯醋酸，甲酸，乙酸，pH離于10時，可補(bǔ)加胺使pH增加到11。載體在pH6附近電導(dǎo)較低，可以與蔗糖密度梯度互相補(bǔ)償，蔗糖濃度高時電導(dǎo)低，所以可把pH6電導(dǎo)低部位放在柱上部，也就是用pH6以下范圍時，陰極在上，而用pH6以上范圍時，陽極在上方。三、蛋白質(zhì)樣品及分離容量 電聚焦有高的分辨力，一般樣品不需提純，分析上可用來測定混合物中某一成分的相對比例：如大量提純蛋白質(zhì)，則應(yīng)預(yù)先初步提純。有些物質(zhì)（如核酸）聚焦時會沉淀，應(yīng)預(yù)先除去。蛋白質(zhì)應(yīng)不含鹽，因鹽濃度高電流大，易發(fā)熱，而且鹽離子遷移至兩極產(chǎn)生酸堿，占據(jù)了分離的有效部位。加樣體積不受限制，最高可達(dá)8085ml。　　等電點(diǎn)聚焦的分離容量受下列幾個因素影響：聚焦后每一區(qū)帶的蛋白量取決于密度梯度所能支持的蛋白質(zhì)，提高密度可以提高分離容量；容量與區(qū)帶高度的平方成正比，降低電壓可使區(qū)帶變寬，提高容量，但分辨率降低，聚焦時間長，用窄的pH梯長范圍可以使區(qū)帶變寬，提高分辨率。用110 ml柱時，每一區(qū)帶蛋白質(zhì)含量最高可達(dá)２025 mg，由于粗蛋白樣品可分為很多區(qū)帶，所以總量可以加至幾百毫克；分離的容量與柱的橫載面成正比，用440 mg柱時，可加粗蛋白質(zhì)5 g，每一區(qū)帶可達(dá)1 g。第六節(jié) 雙向凝膠電泳人類基因組計劃與美國塞萊拉遺傳信息公司于 2001 年在美國《科學(xué)》雜志和英國《自然》雜志聯(lián)合宣布，他們繪制出了準(zhǔn)確、清晰、完整的人