【正文】 糖經(jīng)高溫后部分被降解成D葡萄糖和D果糖，果糖又可被部分水解，產(chǎn)生抑制培養(yǎng)的植物組織生長(zhǎng)的物質(zhì)。高溫還可使碳水化合物和氨基酸發(fā)生反應(yīng)。IAA，NAA，2，4D、激動(dòng)素和玉米素在高溫下是比較穩(wěn)定的。維生素具有不同程度的熱穩(wěn)定性，則維生素B1會(huì)被迅速降解。泛酸鈣、植物組織提取物等要過濾滅菌，不能高溫滅菌，否則會(huì)失去作用。 ，當(dāng)溶液通過濾液后，細(xì)菌的細(xì)胞和真菌的孢子等因大于濾膜直徑而被阻，在需要過濾滅菌的液體量大時(shí)，常使用抽濾裝置；液量小時(shí)，可用注射器。使用前對(duì)其高壓滅菌，將濾膜裝在注射器的靠針管處，將待過濾的液體裝入注射器，推壓注射器活塞桿，溶液壓出濾膜，從針管壓出的溶液就是無菌溶液。 過濾除菌操作步驟： 首先將過濾器、接液瓶用紙包好，濾膜可放在培養(yǎng)皿內(nèi)用紙包好。使用前先經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌30分鐘；在超凈工作臺(tái)上，將濾器裝置裝好，用滅菌無齒鑷子將濾膜安放在隔板上，濾膜粗糙面向上；然后將待除菌的液體注入濾器內(nèi)，開動(dòng)真空泵即可過濾除菌。濾液經(jīng)培養(yǎng)證明無菌生長(zhǎng)后可保存?zhèn)溆谩? 空間采用紫外線和熏蒸滅菌 （1）紫外線滅菌 在接種室、超凈臺(tái)上或接種箱用紫外燈滅菌。紫外線滅菌是利用輻射因子滅菌，細(xì)菌吸收紫外線后，蛋白質(zhì)很核酸發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，引起細(xì)菌的染色體變異，造成死亡。紫外線的波長(zhǎng)為200300nm，其中260nm的殺菌能力最強(qiáng)，但是由于紫外線的穿透能力很弱，所以只適于空氣和物體表面的滅菌。 （2）熏蒸滅菌 用加熱焚燒、氧化等方法，使化學(xué)藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴(kuò)散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。這種方法簡(jiǎn)便，只需要把消毒的空間關(guān)閉緊密即可。 化學(xué)消毒劑的種類很多，它們使微生物的蛋白質(zhì)變性，或競(jìng)爭(zhēng)其酶系統(tǒng)，或降低其表面張力，增加菌體細(xì)胞漿膜的通透性，使細(xì)胞破裂或溶解。一般說來，溫度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，殺菌效果越好。另外，由于消毒劑必須溶解于水才能發(fā)揮作用，所以要制成水溶狀態(tài)，如升汞與高錳酸鉀。還有消毒劑的濃度一般是濃度越大，殺菌能力越強(qiáng)，但石炭酸和酒精例外。 常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時(shí)，房間關(guān)閉緊密，按58ml/m 3 用量，將甲醛置于廣口容器中，加5g/m 3 高錳酸鉀氧化揮發(fā)。熏蒸時(shí)，房間可預(yù)先噴濕以加強(qiáng)效果。冰醋酸也可進(jìn)行加熱熏蒸，但效果不如甲醛。 一些物體表面用藥劑噴霧滅菌 物體表面可用一些藥劑涂搽，噴霧滅菌。如桌面、墻面、雙手、植物材料表面等，可用75%的酒精反復(fù)涂搽滅菌，1%2%%1%的新潔爾滅也可以。 植物材料表面用消毒劑滅菌 從外界或室內(nèi)選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶入培養(yǎng)基，便會(huì)造成培養(yǎng)基污染。因此，植物材料必須經(jīng)嚴(yán)格的表面滅菌處理，再經(jīng)無菌操作手續(xù)接種到培養(yǎng)基上，這一過程叫做接種。接種的植物材料叫做外植體（explant）。 首先，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細(xì)洗干凈，如用適當(dāng)?shù)乃⒆拥人⑾?。把材料切割成適當(dāng)大小，即滅菌容器能放入為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時(shí)，沖洗時(shí)間視材料清潔程度而宜。易漂浮或細(xì)小的材料，可裝入紗布袋內(nèi)沖洗。流水沖洗在污染嚴(yán)重時(shí)特別有用。 洗時(shí)可加入洗衣粉清洗，然后再用自來水沖洗洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著在植物表面的污物，除去脂質(zhì)性的物質(zhì)，便于滅菌液的直接接觸。當(dāng)然，最理想的清洗物質(zhì)是表面活性物質(zhì)吐溫。 第二步是對(duì)材料的表面浸潤(rùn)滅菌。要在超凈臺(tái)或接種箱內(nèi)完成，準(zhǔn)備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70%酒精浸1030秒。由于酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，加之70%酒精穿透力強(qiáng)，也很易殺傷植物細(xì)胞，所以浸潤(rùn)時(shí)間不能過長(zhǎng)。有一些特殊的材料，如果實(shí)、花蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽等等，以及主要取用內(nèi)部的材料，則可只用70%酒精處理稍長(zhǎng)的時(shí)間。處理完的材料在無菌條件下，待酒精蒸發(fā)后再剝除外層，取用內(nèi)部材料。 第三步是用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據(jù)情況選取12種使用見下表。常用滅菌劑使用濃度及效果比較 表滅菌劑名稱使用濃度 %消毒難易滅菌時(shí)間滅菌效果漂白粉飽和溶液易530很好次氯酸鈣910易530很好次氯酸鈉2 （活性氧）易530很好過氧化氫1012最易515好抗菌素450mg/L中3060較好 上述滅菌劑應(yīng)在使用前臨時(shí)配制，氯化汞可短期內(nèi)儲(chǔ)用。次氯酸鈉和次氯酸鈣都是利用分解產(chǎn)生氯氣來殺菌的，故滅菌時(shí)用廣口瓶加蓋較好；升汞是由重金屬汞離子來達(dá)到滅菌的；過氧化氫是分解中釋放原子態(tài)氧來殺菌的，這種藥劑殘留的影響較小，滅菌后用無菌水漂洗34次即可；由于升汞液滅菌的材料，難以對(duì)升汞殘毒去除，所以應(yīng)當(dāng)用無菌水漂洗810次，每次不少于3分鐘，以盡量去除殘毒。 滅菌時(shí)，不瀝干的植物材料轉(zhuǎn)放到燒杯或其他器皿中，記好時(shí)間，倒入消毒溶液，不時(shí)用玻璃棒輕輕攪動(dòng)，以促進(jìn)材料各部分與消毒溶液充分接觸，驅(qū)除氣泡，使消毒徹底。在快到時(shí)間之前12分鐘，開始把消毒液傾入一備好的大燒杯內(nèi)，要注意勿使材料倒出，氫凈后立即倒入無菌水，輕攪漂洗。滅菌時(shí)間是從倒入消毒液開始，至倒入無菌水時(shí)為止。記錄時(shí)間還便于比較消毒效果，以便改正。滅菌液要充分浸沒材料。寧可多用些滅菌液，切勿勉強(qiáng)在一個(gè)體積偏小的容器中使用很多材料滅菌。 在滅菌溶液中加吐溫80或Triton X效果較好，這些表面活性劑主要作用是使藥劑更易于展布，更容易浸入到滅菌的材料表面。但吐溫加入后對(duì)材料的傷害也在增加，應(yīng)注意吐溫的用量和滅菌時(shí)間，%，即在100ml加入15滴。 最后一步是用無菌水漂洗，漂洗要求3分鐘左右，視采用的消毒液種類，漂洗310次左右。無菌水漂洗作用是免除消毒劑殺傷植物細(xì)胞的副作用。滅菌原理 紫外線滅菌的原理: 紫外線滅菌是用紫外線管照射進(jìn)行的。波長(zhǎng)在 220300納米的紫外線稱為“殺生命區(qū)”，其中以260鈉米的殺菌力最強(qiáng)。紫外線作用于細(xì)胞DNA，使DNA鏈上相鄰的嘧啶堿形成嘧啶二聚體（如胸腺嘧啶二聚體），抑制了DNA復(fù)制。另外，空氣在紫外線照射下可以產(chǎn)生臭氧，臭氧也有一定的殺菌作用。紫外線透過物質(zhì)的能力很差，適用于空氣及物體表面的滅菌，照射時(shí)間以視紫外線燈管的功率大小、被照空間及面積大小，根據(jù)滅菌效果測(cè)定結(jié)果而定。由于紫外線對(duì)人體有傷害作用，因此，不要在紫外線燈照射下進(jìn)行操作。 氯化汞滅菌的原理： 氯化汞也稱升汞，是一種劇毒的重金屬鹽殺菌劑，其殺菌的原理是 Hg2+可與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，使細(xì)菌蛋白變性，酶失活。%%，浸泡612分鐘時(shí)，就可以有效地殺死附著在外植體表面的細(xì)菌及真菌芽孢，滅菌效果極好。但用氯化汞滅過菌的外植體材料要用無菌水反復(fù)多次洗滌（一般不少于 5次），才可將殘留的藥劑除凈。使用氯化汞給環(huán)境造成污染，一般情況下，應(yīng)盡量用其它消毒劑滅菌，而以少用或不用氯化汞為易。 次氯酸鈉滅菌的原理： 次氯酸鈉又稱為 “安替福民”，%,使用時(shí)稀釋35倍,浸泡外植體530分鐘,滅菌后易于除去,不留殘余,殺菌力強(qiáng),對(duì)植物材料無害,是植物組織培養(yǎng)常使用的殺菌劑之一。 漂白粉滅菌的原理： 漂白粉為白色粉末，一般含 10%20%（質(zhì)量/體積）的次氯酸鈣[Ca（ClO）2],使用時(shí)用飽和溶液，殺菌的原理在于它分解出具有殺菌作用的氯氣。氯與蛋白質(zhì)中的氨基結(jié)合，使菌體蛋白質(zhì)氧化，代謝功能發(fā)生障礙。注意漂白粉腐蝕金屬、棉織品，刺激皮膚，易吸潮散失有效氯而失效，平時(shí)要密封儲(chǔ)藏，最好現(xiàn)配現(xiàn)用，不要儲(chǔ)藏太久。 酒精滅菌的原理： 酒精具有較強(qiáng)的穿透力和殺菌力，它使細(xì)菌蛋白質(zhì)變性。使用的濃度一般為 70%75%。處理時(shí)間1530秒，不宜太長(zhǎng)，因?yàn)榧?xì)胞容易收縮脫水。它具有浸潤(rùn)和滅菌的雙重作用，適用于表面消毒，但不能達(dá)到徹底的滅菌，必須結(jié)合其它藥劑滅菌。 為了提高乙醇的殺菌效果，%的酸或堿,以改變細(xì)胞表面帶電荷的性質(zhì)而增加膜透性,提高乙醇的殺菌效果。 高錳酸鉀滅菌的原理： 高錳酸鉀能使細(xì)菌酶蛋白中的基氧化成二硫基而失去酶活性。濃度稀釋時(shí)起氧化作用殺死細(xì)菌，日常生活中通常用作皮膚、果蔬的表面消毒劑，在一盆清水中加幾粒高錳酸鉀就可起到殺菌的作用。接 種 接種時(shí)由于有一個(gè)敞口的過程，所以是極易引起污染的時(shí)期，這一時(shí)期主要由空氣中的細(xì)菌和工作人員本身引起，接種室要嚴(yán)格進(jìn)行空間消毒。接種室內(nèi)保持定期用1%3%的高錳酸鉀溶液對(duì)設(shè)備、墻壁、地板等進(jìn)行搽洗。除了使用前用紫外線和甲醛滅菌外，還可在使用期間用70%的酒精或3%的來蘇兒噴霧，使空氣中灰塵顆粒沉降下來。無菌操作可按以下步驟進(jìn)行： （1）在接種4小時(shí)前用甲醛熏蒸接種室，并打開其內(nèi)紫外線燈進(jìn)行殺菌； （2）在接種前20分鐘，打開超凈工作臺(tái)的風(fēng)機(jī)以及臺(tái)上的紫外線燈； （3）接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實(shí)驗(yàn)服，并換穿拖鞋等； （4）上工作臺(tái)后，用酒精棉球搽拭雙手，特別是指甲處。然后搽拭工作臺(tái)面； （5）先用酒精棉球搽拭接種工具，再將鑷子和剪刀從頭至尾過火一遍，然后反復(fù)過火尖端處，對(duì)培養(yǎng)皿要過火烤干； （6）接種時(shí)，接種員雙手不能離開工作臺(tái)，不能說話、走動(dòng)和咳嗽等； （7）接種完畢后要清理干凈工作臺(tái)，可用紫外線燈滅菌30分鐘，若連續(xù)接種，每5天要大強(qiáng)度滅菌一次。 接種是將已消毒好的根、莖、葉等離體器官，經(jīng)切割或剪裁成小段或小塊，放入培養(yǎng)基的過程。現(xiàn)將接種前后的程序連貫地介紹。無菌接種步驟： （ 1 ）將初步洗滌及切割的材料放入燒杯，帶入超凈臺(tái)上，用消毒劑滅菌，再用無菌水沖洗，最后瀝去水分，取出放置在滅過菌的紗布上或?yàn)V紙上。 （ 2 ）材料吸干后，一手拿鑷子、一手拿剪刀或解剖刀，對(duì)材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈?。如葉片切成 平方的小塊；莖切成含有一個(gè)節(jié)的小段。微莖尖要?jiǎng)兂芍缓?12 片幼葉的莖尖大小等。在接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。 （ 3 ）用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。具體操作過程（以試管為例）是：先解開包口紙，將試管幾乎水平拿著，使試管口靠近酒精燈火焰，并將管口在火焰上方轉(zhuǎn)動(dòng)，使管口里外灼燒數(shù)秒鐘。若用棉塞蓋口，可先在管口外面灼燒，去掉棉塞，再燒管口里面。然后用鑷子夾取一塊切好的外植體送入試管內(nèi)，輕輕插入培養(yǎng)基上。若是葉片直接附在培養(yǎng)基上，以放 13 塊為宜。至于材料放置方法除莖尖、莖段要正放（尖端向上）外，其他尚無統(tǒng)一要求。接種完后，將管口在火焰上再灼燒數(shù)秒種。并用棉塞，塞好后，包上包口紙，包口紙里面也要過火。培 養(yǎng) 培養(yǎng)指把培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)室（有光照、溫度條件）里，使之生長(zhǎng)，分裂和分化形成愈傷組織或進(jìn)一步分化成再生植株的過程。 培養(yǎng)方法 （1）固體培養(yǎng)法 即用瓊脂固化培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物材料的方法。是現(xiàn)在最常用的方法。雖然該方法設(shè)備簡(jiǎn)單，易行，但養(yǎng)分分布不均，生長(zhǎng)速度不均衡，并常有褐化中毒現(xiàn)象發(fā)生。 （2）液體培養(yǎng)法 即用不加固化劑的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)植物材料的方法。由于液體中氧氣含量較少，所以通常需要通過攪動(dòng)或振動(dòng)培養(yǎng)液的方法以確保氧氣的供給，采用往復(fù)式搖床或旋轉(zhuǎn)式搖床進(jìn)行培養(yǎng)，其速度一般為50100r/min，這種定期浸沒的方法，既能使培養(yǎng)基均一，又能保證氧氣的供給。 培養(yǎng)步驟 （1）初代培養(yǎng) 初代培養(yǎng)旨在獲得無菌材料和無性繁殖系。即接種某些外植體后，最初的幾代培養(yǎng)。初代培養(yǎng)時(shí)，常用誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基中含有較多的細(xì)胞分裂素和少量的生長(zhǎng)素。初代培養(yǎng)建立的無性繁殖系包括：莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等。根據(jù)初代培養(yǎng)時(shí)發(fā)育的方向可分為： 1）頂芽和腋芽的發(fā)育 采用外源的細(xì)胞分裂素，可促進(jìn)使具有頂芽或沒有腋芽的休眠側(cè)芽啟動(dòng)生長(zhǎng)，從而形成一個(gè)微型的多枝多芽的小灌木叢狀的結(jié)構(gòu)。在幾個(gè)月內(nèi)可以將這種叢生苗的一個(gè)枝條轉(zhuǎn)接繼代，重復(fù)芽苗增殖的培養(yǎng)，并且迅速獲得多數(shù)的嫩莖。然后將一部分嫩莖轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，就能得到可種植到土壤中去的完整小植株。一些木本植物和少數(shù)草本植物也可以通過這種方式來進(jìn)行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。這種繁殖方式也稱作微型繁殖，它不經(jīng)過發(fā)生愈傷組織而再生，所以是最能使無性系后代保持原品種的一種繁殖方式。 適宜這種再生繁殖的植物，在采樣時(shí)，只能采用頂芽、側(cè)芽或帶有芽的莖切段，其他如種子萌發(fā)后取枝條也可以。 莖尖培養(yǎng)可看作是這方面較為特殊的一種方式。它采用極其幼嫩的頂芽的莖尖分生組織作為外植體進(jìn)行接種。在實(shí)際操作中，采用包括莖尖分生組織在內(nèi)的一些組織來培養(yǎng)，這樣便保證了操作方便以及容易成活。 用靠培養(yǎng)定芽得到的培養(yǎng)物一般是莖節(jié)較長(zhǎng)，有直立向上的莖梢，擴(kuò)繁時(shí)主要用切割莖段法，如香石竹、矮牽牛、菊花等。但特殊情況下也會(huì)生出不定芽，形成芽叢。 2）不定芽的發(fā)育 在培養(yǎng)中由外植體產(chǎn)生不定芽，通常首先要經(jīng)脫分化過程，形成愈傷組織的細(xì)胞。然后，經(jīng)再分化，即由這些分生組織形成器官原基，它在構(gòu)成器官的縱軸上表現(xiàn)出單向的極性（這與胚狀體不同）。多數(shù)情況下它形成芽，后形成根。 另一種方式是從器官中直接產(chǎn)生不定芽，有些植物具有從各個(gè)器官上長(zhǎng)出不定芽的能力如矮牽牛、福祿考、懸鉤子等。當(dāng)在試管培養(yǎng)的條件下，培養(yǎng)基中提供了營(yíng)養(yǎng)，特別是提供了連續(xù)不斷植物激素的供應(yīng)，使植物形成不定芽的能力被大大地激發(fā)起來。許多種類的外植體表面幾乎全部為不定芽所覆蓋。在許多常規(guī)方法中不能無性繁殖的種類，在試管條件下卻能較容易地產(chǎn)生不定芽而再生，如柏科，松科，銀杏等一些植物。許多單子葉植物儲(chǔ)藏器官能強(qiáng)烈地發(fā)生不定芽，用百合鱗片的切塊就可大量形成不定鱗莖。 在不定芽培養(yǎng)時(shí)，也常用誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基。用靠培養(yǎng)不定芽得到的培養(yǎng)物，一般采用芽叢進(jìn)行繁殖，如非洲菊、草莓等。 3）體細(xì)胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育 體細(xì)胞胚狀體類似于合子胚但又有所不同，它也通過球形，心形，魚雷形和子葉