【正文】 到摩爾量，誤差本身就很大（雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法不一定非要測標(biāo)準(zhǔn)品的 濃度）；濃度）； 定量定量 PCR儀的誤差儀的誤差 耗材引起的誤差，耗材引起的誤差， 96空板封口膜透光性的差異等空板封口膜透光性的差異等六、誤差分析及操作規(guī)范六、誤差分析及操作規(guī)范誤差分析、誤差分析（（ 3）、相對(duì)定量時(shí)內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定引起的誤差）、相對(duì)定量時(shí)內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定引起的誤差（（ 4）、操作引起的誤差）、操作引起的誤差 樣品處理、選取、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、加樣，操作過程中引起的誤樣品處理、選取、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、加樣，操作過程中引起的誤 差。差。操作規(guī)范、操作規(guī)范 熒光定量熒光定量 PCR是一項(xiàng)對(duì)操作要求很高的實(shí)驗(yàn)，同時(shí)又是花費(fèi)很高的一項(xiàng)是一項(xiàng)對(duì)操作要求很高的實(shí)驗(yàn)，同時(shí)又是花費(fèi)很高的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，這就要求必須最大程度的減少誤差或避免錯(cuò)誤。要想達(dá)到這個(gè)目實(shí)驗(yàn)，這就要求必須最大程度的減少誤差或避免錯(cuò)誤。要想達(dá)到這個(gè)目標(biāo)，我們必須從樣品的選取開始到上樣檢測，每一步都要規(guī)范操作。標(biāo)，我們必須從樣品的選取開始到上樣檢測，每一步都要規(guī)范操作。（（ 1）、樣品的處理及選?。悠返奶幚砑斑x取 處理樣品時(shí)，必須確保樣品都得到了充分的處理。如測定一種藥物處理樣品時(shí)，必須確保樣品都得到了充分的處理。如測定一種藥物 到小白鼠免疫系統(tǒng)的影響，必須做到每次飼喂時(shí)此藥品完全被小白到小白鼠免疫系統(tǒng)的影響，必須做到每次飼喂時(shí)此藥品完全被小白 鼠攝食；選取試驗(yàn)樣品時(shí)，要保證選取的組織盡可能的純，不要污鼠攝食；選取試驗(yàn)樣品時(shí)，要保證選取的組織盡可能的純，不要污 染其他組織，如選取脾臟組織時(shí)，盡可能的選取脾臟，不能混有結(jié)染其他組織，如選取脾臟組織時(shí)，盡可能的選取脾臟，不能混有結(jié) 締組織等，樣品選取好后，即可放入液氮或超低溫冰箱保存。締組織等，樣品選取好后，即可放入液氮或超低溫冰箱保存。六、誤差分析及操作規(guī)范六、誤差分析及操作規(guī)范操作規(guī)范、操作規(guī)范（（ 2）、核酸提?。?、核酸提取 加入液氮研磨要徹底，蛋白、多糖、多酚類物質(zhì)要去除干凈，確保加入液氮研磨要徹底，蛋白、多糖、多酚類物質(zhì)要去除干凈，確保 得到高質(zhì)量的核酸，分光光度計(jì)檢測核算質(zhì)量，得到高質(zhì)量的核酸，分光光度計(jì)檢測核算質(zhì)量， RNA OD260/280＝＝ ，左右， DNA OD260/280＝＝ ，最好再做電泳檢測；同一樣左右，最好再做電泳檢測；同一樣 品要提取品要提取 2到到 3個(gè)個(gè) RNA，所剩余的樣品不要丟棄，繼續(xù)低溫保存。，所剩余的樣品不要丟棄，繼續(xù)低溫保存。（（ 3）、得到的）、得到的 RNA立即反轉(zhuǎn)錄為立即反轉(zhuǎn)錄為 cDNA， RNA樣品最好不要存放，反轉(zhuǎn)錄所樣品最好不要存放，反轉(zhuǎn)錄所得得 cDNA要用看家基因檢測。要用看家基因檢測。（（ 4）、對(duì)于精度要求較高的定量）、對(duì)于精度要求較高的定量 PCR，最好先在樣品的所有組織類型內(nèi)做，最好先在樣品的所有組織類型內(nèi)做 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析，找出表達(dá)恒定基因作為內(nèi)參。內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析，找出表達(dá)恒定基因作為內(nèi)參。（（ 5）、做定量）、做定量 PCR時(shí)，先把除模板外的所有試劑預(yù)混，然后分裝到時(shí)，先把除模板外的所有試劑預(yù)混，然后分裝到 PCR管管 中，分裝時(shí)盡量采用排槍，加樣時(shí)盡量最好采用排槍。中，分裝時(shí)盡量采用排槍，加樣時(shí)盡量最好采用排槍。（（ 6）、體系中最好摻入）、體系中最好摻入 ROX參比熒光，消除光程差和加樣的偏差。參比熒光，消除光程差和加樣的偏差。六、誤差分析及操作規(guī)范六、誤差分析及操作規(guī)范操作規(guī)范、操作規(guī)范（（ 7）、重復(fù)操作）、重復(fù)操作 讓重復(fù)操作最大的修正偏差？最有意義的重復(fù)是在提取樣品讓重復(fù)操作最大的修正偏差？最有意義的重復(fù)是在提取樣品 RNA時(shí)時(shí) 就重復(fù)，同一個(gè)樣品，分別提取就重復(fù)，同一個(gè)樣品，分別提取 3份份 RNA， 3份份 RNA都做反轉(zhuǎn)錄，所都做反轉(zhuǎn)錄，所 得的得的 3份份 cDNA都做定量都做定量 PCR檢測，這樣的重復(fù)之所以最有意義是因檢測，這樣的重復(fù)之所以最有意義是因 為我們是把為我們是把 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、上機(jī)檢測三步做了重復(fù)，這樣得出提取、反轉(zhuǎn)錄、上機(jī)檢測三步做了重復(fù)，這樣得出 的平均值要比只在上機(jī)檢測時(shí)對(duì)同一的平均值要比只在上機(jī)檢測時(shí)對(duì)同一 cDNA樣品做三個(gè)重復(fù)要有意義樣品做三個(gè)重復(fù)要有意義 的多。的多。 同一個(gè)同一個(gè) cDNA樣品做三個(gè)重復(fù)定量檢測求平均值主要是消除加樣時(shí)的樣品做三個(gè)重復(fù)定量檢測求平均值主要是消除加樣時(shí)的 誤差，排槍加樣時(shí)，誤差很小，加樣時(shí)的誤差可以通過設(shè)幾個(gè)重復(fù)誤差，排槍加樣時(shí)，誤差很小，加樣時(shí)的誤差可以通過設(shè)幾個(gè)重復(fù) 檢測出來。檢測出來。六、誤差分析及操作規(guī)范六、誤差分析及操作規(guī)范操作規(guī)范、操作規(guī)范同一 cDNA樣品的三個(gè)重復(fù)六、誤差分析及操作規(guī)范六、誤差分析及操作規(guī)范模板濃度越低，染料法的誤差越大。如圖一系列梯度稀釋的模板，理論上它們模板濃度越低，染料法的誤差越大。如圖一系列梯度稀釋的模板，理論上它們在擴(kuò)增曲線上的在擴(kuò)增曲線上的 CT值之差，應(yīng)該相等，但是后邊幾個(gè)濃度低的樣品值之差，應(yīng)該相等，但是后邊幾個(gè)濃度低的樣品 CT值明顯提值明顯提前了，由熔解曲線可知對(duì)于濃度低的樣品，引物二聚體引起的誤差非常嚴(yán)重。前了，由熔解曲線可知對(duì)于濃度低的樣品，引物二聚體引起的誤差非常嚴(yán)重。七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控?zé)晒舛?、熒光定?PCR實(shí)驗(yàn)中污染源的分析實(shí)驗(yàn)中污染源的分析（（ 1）、）、 PCR產(chǎn)物引起的污染產(chǎn)物引起的污染 在檢測過程中，熒光定量在檢測過程中，熒光定量 PCR產(chǎn)物都是封閉在產(chǎn)物都是封閉在 PCR管中的，不存在開管中的，不存在開 管檢測，所以有污染的話，最有可能是因?yàn)殡娪緳z測熒光定量管檢測，所以有污染的話，最有可能是因?yàn)殡娪緳z測熒光定量 PCR 產(chǎn)物時(shí)引起的污染，只要將電泳室與產(chǎn)物時(shí)引起的污染，只要將電泳室與 PCR加樣室隔離開，就能有效加樣室隔離開，就能有效 的避免的避免 PCR產(chǎn)物的污染。產(chǎn)物的污染。（（ 2）、標(biāo)準(zhǔn)品引起的污染）、標(biāo)準(zhǔn)品引起的污染 常用的標(biāo)準(zhǔn)品有含有目的基因的質(zhì)粒、純化后的常用的標(biāo)準(zhǔn)品有含有目的基因的質(zhì)粒、純化后的 PCR產(chǎn)物等，由于產(chǎn)物等，由于 標(biāo)準(zhǔn)品的濃度是一系列從高到低梯度稀釋的，所以在稀釋過程中，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度是一系列從高到低梯度稀釋的，所以在稀釋過程中， 有可能引起污染。有可能引起污染。（（ 3）、高濃度的樣品引起的污染）、高濃度的樣品引起的污染 高濃度的陽性樣品在加樣過程中可能會(huì)形成氣溶膠，造成污染。高濃度的陽性樣品在加樣過程中可能會(huì)形成氣溶膠，造成污染。七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控?zé)晒舛?、熒光定?PCR實(shí)驗(yàn)中污染的防控實(shí)驗(yàn)中污染的防控（（ 1）、對(duì)于）、對(duì)于 PCR產(chǎn)物引起的污染產(chǎn)物引起的污染 最簡單有效地辦法就是將電泳室與加樣室徹底隔離開，做到每個(gè)房最簡單有效地辦法就是將電泳室與加樣室徹底隔離開，做到每個(gè)房 間都有專屬的移液器，做到移液器專用；或者采用間都有專屬的移液器，做到移液器專用；或者采用 dU代替代替 dT配合配合 UNG酶酶 ， 是解決是解決 PCR產(chǎn)物污染的有效辦法，但是成本較高。產(chǎn)物污染的有效辦法，但是成本較高。（（ 2）、對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品引起的污染）、對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品引起的污染 目前只能是以預(yù)防，加標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)最好采用專用移液器，不要和加樣目前只能是以預(yù)防，加標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)最好采用專用移液器，不要和加樣 的移液器交叉使用，加標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)最好在通風(fēng)廚中進(jìn)行，和加樣的操的移液器交叉使用，加標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)最好在通風(fēng)廚中進(jìn)行，和加樣的操 作臺(tái)隔離開。作臺(tái)隔離開。（（ 3）、對(duì)于樣品間的檢查污染）、對(duì)于樣品間的檢查污染 樣品間的交叉污染往往是因?yàn)楦邼舛鹊臉悠吩诩訕邮倚纬闪藲馊軜悠烽g的交叉污染往往是因?yàn)楦邼舛鹊臉悠吩诩訕邮倚纬闪藲馊? 膠，因?yàn)闃悠返哪z，因?yàn)闃悠返?cDNA鏈較長，經(jīng)常開紫外燈，把長鏈鏈較長，經(jīng)常開紫外燈，把長鏈 cDNA打斷，能打斷，能 有效避免此類污染的發(fā)生，另外保持加樣室空氣流通也有助于防止有效避免此類污染的發(fā)生，另外保持加樣室空氣流通也有助于防止 此類污染。此類污染。七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控?zé)晒舛?、熒光定?PCR實(shí)驗(yàn)中污染的防控實(shí)驗(yàn)中污染的防控（（ 4）、對(duì)于未知污染源的頑固的污染的防控）、對(duì)于未知污染源的頑固的污染的防控 這類污染也經(jīng)常出現(xiàn)，找不到明確的污染源，而且此類污染又非常這類污染也經(jīng)常出現(xiàn)，找不到明確的污染源，而且此類污染又非常 頑固，對(duì)于這種情況，最好的辦法就是不去管它，在采用絕對(duì)定量頑固，對(duì)于這種情況，最好的辦法就是不去管它，在采用絕對(duì)定量 和雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法時(shí)，污染的初始模板量可由陰性對(duì)照檢測出來，知和雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法時(shí)，污染的初始模板量可由陰性對(duì)照檢測出來，知 道了污染的初始模板量后，我們可以把測得樣品的初始模板量減去道了污染的初始模板量后，我們可以把測得樣品的初始模板量減去 污染的初始模板量，在分析時(shí)就避免了污染造成的誤差。污染的初始模板量，在分析時(shí)就避免了污染造成的誤差。七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控圖中最后一個(gè)樣品為陰性對(duì)照，本來應(yīng)該圖中最后一個(gè)樣品為陰性對(duì)照，本來應(yīng)該是一直線，但是儀器也檢測到了熒光信號(hào)是一直線，但是儀器也檢測到了熒光信號(hào)七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控電泳結(jié)果顯示，該陰性對(duì)照確實(shí)有電泳結(jié)果顯示，該陰性對(duì)照確實(shí)有 PCR產(chǎn)物出現(xiàn)產(chǎn)物出現(xiàn)七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控通過定量 PCR檢測，測得該陰性樣品中含有 227個(gè)初始模板。假如這個(gè)污染屬于是頑固的未知污染，可以用正常樣品測得的初始模板量減去 227，來避免污染引起的誤差八、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析八、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將得到的結(jié)果進(jìn)行分析，現(xiàn)在很多軟件都帶有結(jié)果的自動(dòng)分實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將得到的結(jié)果進(jìn)行分析，現(xiàn)在很多軟件都帶有結(jié)果的自動(dòng)分析功能，可以將結(jié)果直接轉(zhuǎn)化為各種圖表及柱狀圖。對(duì)于和實(shí)驗(yàn)預(yù)期偏離析功能，可以將結(jié)果直接轉(zhuǎn)化為各種圖表及柱狀圖。對(duì)于和實(shí)驗(yàn)預(yù)期偏離比較大的樣品，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)。比較大的樣品，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)。謝 謝！電話： 15238020968， ： 458261751，都市巡洋艦如有問題需要交流，請隨時(shí)聯(lián)系