【導(dǎo)讀】中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部。二○○二年十一月。醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)消毒技術(shù)規(guī)范。消毒技術(shù)規(guī)范目錄。一次性使用醫(yī)療用品產(chǎn)品細(xì)菌和真菌污染的檢測(cè).......94. 復(fù)方消毒產(chǎn)品有效成分含量測(cè)定的指導(dǎo)原則..........123. 污物的消毒處理..

　　

【正文】 肉湯培養(yǎng)基，輕柔吹吸 數(shù)次，使菌種融化 分散。取含 5 ml～ 10ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置 37℃ 培 養(yǎng) 18h～ 24h。用接種環(huán)取第 1代培養(yǎng)的菌懸液，劃線(xiàn)接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，于 37℃培養(yǎng) 18h～ 24h。挑取上述第 2 代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，于 37℃ 培養(yǎng) 18h～ 24h，即為第 3 代培養(yǎng)物。 2）用 吸管吸取 ml～ 第 3代～ 5代的 18h～ 24h 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，接種于羅氏瓶中營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，將其搖動(dòng)使菌液布滿(mǎn)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的表面，再將多余肉湯培養(yǎng)物吸出， 將羅氏瓶 置 于 37℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng) 5d～ 7d。 3）用接種環(huán)取菌樣少許涂于玻片上，固定后以改良芽孢染色法染色，并在顯微鏡（油鏡） 下進(jìn)行鏡檢。 當(dāng)芽孢形成率達(dá) 95% 以上 時(shí) ，即 可進(jìn)行以下處理。否則， 應(yīng)繼續(xù) 在室溫下放置 一定時(shí)間，直至達(dá)到上述芽孢形成率后再進(jìn)行以下處理。 改良芽孢染色法：①用接種環(huán)取菌樣涂布于玻片上，待自然干燥。而后通過(guò)火焰加熱將菌固定于玻片上。②將涂片放入平皿內(nèi)，片上放兩層濾紙，滴加足量的 % 孔雀綠水溶液。將平皿蓋好，放 54℃ ～56℃ 條件下，加熱 30min。取出，去濾紙，用自來(lái)水沖洗殘留孔雀綠溶 液。 ③ 加 % 沙黃水溶液，染 1min。水洗，待干后鏡檢。芽孢呈綠色，菌體呈紅色。 4）羅氏瓶培養(yǎng)物，用 吸管加 無(wú)菌蒸餾水于每一羅氏瓶中，以 L棒輕輕推刮下菌苔。吸出第一批洗下的菌懸液，再向瓶?jī)?nèi)吸加 無(wú)菌蒸餾水，重復(fù)洗菌一遍。將第一 和第二批洗下的菌懸液集中于一含玻璃珠的無(wú)菌三角燒瓶中，振搖 5min，打碎菌塊，使成均勻的芽孢懸液。 5）必要時(shí)，將盛裝菌懸液的三角燒瓶置 45℃ 水浴中 24h，使菌自溶斷鏈，分散成單個(gè)芽孢。 6）用無(wú)菌棉花或紗布過(guò)濾芽孢懸液，清除其中的瓊脂凝塊。 7）將過(guò)濾后的芽孢懸液，置無(wú)菌離心管內(nèi)，以 3000 r/min 速度離心 30min。棄上清液，加蒸餾水吹吸使芽孢重新懸浮。再離心和重新懸浮清洗，先后共 3遍。 — 32— 8）將洗凈的芽孢懸浮于三角燒瓶?jī)?nèi)蒸餾水中，并加入適量小玻璃珠。 9）將芽孢液放于 80℃ 水浴中 10min（或 60℃ ， 30min），以殺滅殘余的細(xì)菌繁殖體。待冷至室溫后，保存于 4℃ 冰箱中備用。 有效使用期為半年。 10）芽孢懸液在使用時(shí)，應(yīng)先進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。 11）懷疑有雜菌污染時(shí)，應(yīng)以菌落形態(tài)、革蘭染色與生化試驗(yàn)等法進(jìn)行鑒定。 菌片的制備程序 （ 1）消毒試驗(yàn)中使用的菌片是以菌液滴加于載體上制成。載體應(yīng)根據(jù)消毒對(duì)象選擇，常用的有金屬、玻璃、濾紙、線(xiàn)、 棉 布等。根據(jù)其特點(diǎn)選擇適宜材料載體作為代表。載體可以為方形，大小為 10mm179。10mm 。 當(dāng)以金屬片為載體時(shí)，因方形金屬載體在振敲時(shí)可將玻璃試管撞碎，故改用 12mm 直徑圓形金屬片（厚 ）。 （ 2）所用載體（除濾紙片外）于染菌前，應(yīng)進(jìn)行脫脂處理。脫脂方法如下： ① 將載體放 在含 洗滌劑 的水中煮沸 30 min； ② 以自來(lái)水洗凈； ③ 用蒸餾水煮沸 10min； ④ 用蒸餾水漂洗至 pH 呈中性 ； ⑤ 晾干 、熨平備用。 （ 3）布片用白平紋棉布制作。在剪開(kāi)前，先將脫脂的布?jí)K按載體規(guī)定的大小，抽去邊緣一周的經(jīng)緯紗各一根，再按抽紗痕剪開(kāi)。此法制成的載體大小一致，且無(wú)毛邊。金屬片以不銹鋼制作，紙片以新華濾紙制作。 （ 4）載體經(jīng)壓力蒸汽滅菌后，使用滴染法 染菌 。 染菌用菌懸液：使用 TSB營(yíng)養(yǎng)肉湯配制。細(xì)菌繁殖體，可直接使用經(jīng)18h～ 24h培養(yǎng)的斜面 培養(yǎng)物，細(xì)菌芽孢可使用 4℃ 冰箱貯存液。含菌量約為 1179。10 8cfu/ml～ 5179。10 8cfu/ml，可使用濁度計(jì)調(diào)整菌液濃度。 滴染法染菌時(shí)，將經(jīng)滅菌的載體片平鋪于無(wú)菌平皿 內(nèi)，逐片滴加菌液。菌液滴加量每片為 10μl 。用 10μl 移液器接滅菌塑料吸頭滴染菌液，并用接種環(huán)涂勻整個(gè)載體表面。滴染菌液后，染菌載體可置 37℃溫箱內(nèi)干 燥 （約 20min～ 30min），或置室溫下自然陰干后再使用。 （ 5）每個(gè)菌片的回收菌數(shù)，按活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)所得結(jié)果，應(yīng)為 5179。10 5 cfu/片～ 5179。10 6 cfu/片。 注意事項(xiàng) （ 1）用濁度計(jì)測(cè)定的菌懸液濃度，只用于在滴染菌片時(shí)對(duì)菌懸液稀釋度的估計(jì)。作為菌懸液含菌濃度或菌片染菌量的正式報(bào)告（如殺菌試驗(yàn)中陽(yáng)性對(duì)照組菌懸液或菌片所含菌量），必須 以活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)的實(shí)測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)，不得使用根據(jù)比濁法判定的估計(jì)值。 （ 2）滴染時(shí)，菌液滴加量不宜過(guò)多，避免流散影響染菌的準(zhǔn)確性。 （ 3） 細(xì)菌繁殖體在烤干過(guò)程中，可引起部分死亡，如銅綠假單胞菌在 37℃ 干 燥 過(guò)程中，滴度最高可下降 1個(gè)對(duì)數(shù)值。此時(shí)，應(yīng)提高初始菌濃度，以便達(dá)到所需的菌量 。 （ 4）配制菌懸液和制備菌片時(shí)，嚴(yán)格按無(wú)菌要求操作，以防污染 — 33— 雜菌，影響隨后殺菌試驗(yàn)的結(jié)果。 （ 5）用帶橡皮塞的容器保存菌液時(shí)，應(yīng)將其預(yù)先煮沸 10min 進(jìn)行脫硫處理。 （ 6）制得的菌懸液和菌片，用畢應(yīng)隨時(shí)放入冰箱內(nèi)，盡量減少在室溫下放置 時(shí)間，以 減少 細(xì)菌的自然死亡。 活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)技術(shù) 適用范圍 測(cè)定細(xì)菌懸液、菌片、采樣液等樣本中含有活菌的數(shù)量。 試驗(yàn)器材 （ 1）刻度吸管（ 、 ）。 （ 2） 稀釋液 ：見(jiàn)附錄 A。 （ 3）營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 ： 見(jiàn)附錄 A。 （ 4）電動(dòng)混合器 操作程序 本規(guī)范要求在殺菌試驗(yàn)中的活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)統(tǒng)一使用傾注法。其操作程序如下。 （ 1）對(duì)菌懸液可直接進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。對(duì)菌片、采樣棉拭與小型固體樣本等，應(yīng)將其上的細(xì)菌洗下成為菌懸液后進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。洗 菌時(shí)，一般以稀釋液為洗液。具體方法如下 : 取含 稀釋液無(wú)菌試管，對(duì)菌片或小型固體樣本直接投入即可，對(duì)棉拭則將其采樣端剪入管內(nèi)，每管一份樣本。而后，用電動(dòng)混合器混合 20s（或在手掌上用力振敲 80 次），將菌洗下形成菌懸液。以上操作應(yīng)嚴(yán)格按無(wú)菌要求進(jìn)行。 （ 2）將試管按需要數(shù)量分組排列于試管架上， 每管加入 稀釋液。各組由左向右，逐管標(biāo)上 10 10 103......等。 （ 3）將菌懸液樣本在用電動(dòng)混合器混合 20s（或在手掌上用力振敲 80次），隨即吸取 101 管內(nèi)。 （ 4）將 101 管依前法用電動(dòng)混合器混合 20s（或在手掌上用力振敲 80次），混勻，再吸取出 102 管內(nèi)。如此類(lèi)推，直至最后一管。必要時(shí)，還可作某稀釋度的 1:1或 1:4稀釋。 （ 5）選擇適宜稀釋度試管（以預(yù)計(jì)生長(zhǎng)菌落數(shù)每平板為 15cfu～300cfu 者為宜），吸取其中混合均勻的懸液 加于無(wú)菌平皿內(nèi)。每一稀釋度接種 3個(gè)平皿。一般需接種 2個(gè)～ 3個(gè)不同稀釋度。平皿加樣前，應(yīng)先按組編號(hào)，以免弄混。 （ 6） 將冷 至 40℃ ～ 45℃ 的熔化營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，傾 注于已加入樣液 的平皿中，每平皿 15ml～ 20ml。 （ 7）將平皿蓋好，即刻輕輕搖動(dòng)混勻，平放于臺(tái)上。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，使底向上，置 37℃ 溫箱內(nèi)培養(yǎng)。 （ 8）每日觀(guān)察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間（細(xì)菌繁殖體為 48h，白色念珠菌與細(xì)菌芽孢為 72h），計(jì)數(shù)最終結(jié)果的菌落數(shù)。 （ 9）對(duì)菌片和采樣棉拭洗液的活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)，先按各試驗(yàn)要求處理（如去除殘留消毒劑等），而后取其最終樣液按上法進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。 （ 10）計(jì)數(shù)菌落時(shí)，一般以肉眼觀(guān)察，必要時(shí)用放大鏡檢查。以菌 — 34— 落數(shù)在 15cfu～ 300cfu的平板為準(zhǔn)，每個(gè)稀釋度 3 個(gè)平板 生長(zhǎng)菌落數(shù)全合乎上述標(biāo)準(zhǔn)，則以該 3個(gè)平板的菌落平均值作為結(jié)果；若有 2個(gè)符合上述標(biāo)準(zhǔn)，則以該合格的兩個(gè)平板菌落的平均值為結(jié)果。 但對(duì)黑曲霉菌活菌計(jì)數(shù)及殺滅試驗(yàn)時(shí)，平板菌落數(shù)應(yīng)在 15cfu～ 100cfu之間。 對(duì)估計(jì)菌量極少的樣本（如消毒處理后樣本），在培養(yǎng)計(jì)數(shù)時(shí)可不作稀釋?zhuān)词蛊桨寰鋽?shù)未達(dá) 15時(shí)，亦可用其計(jì)算最終結(jié)果。 將求得的平均菌落值，再乘以稀釋倍數(shù)，即得每毫升原樣液中的菌量。菌量單位為 cfu。 活菌計(jì)數(shù)中技術(shù)操作誤差的測(cè)定 試驗(yàn)者在活菌計(jì)數(shù)中因技術(shù)操作而引起的菌落數(shù)誤差率（平板間、稀 釋度間）不宜超過(guò) 10%。對(duì)誤差率的自檢，可按以下公式計(jì)算。 （ 1）平板間誤差率計(jì)算公式 ： %100?? 平板間菌落平均數(shù)平板間菌落數(shù)平均差平板間誤差率 平板數(shù) 的絕對(duì)值之和各平板菌落數(shù)平板間菌落平均數(shù)平板間菌落數(shù)平均差 )( ?? 平板數(shù)各平板菌落數(shù)之和平板間菌落平均數(shù) ? （ 2）稀釋度間誤差率計(jì)算公式 ： %100?? 稀釋度間菌落平均數(shù)稀釋度間菌落數(shù)平均差稀釋度間菌落數(shù)誤差率 稀釋度數(shù) 的絕對(duì)值之和各稀釋度菌落數(shù)稀釋度間菌落平均數(shù)稀釋度間菌落平均差 )(= 稀釋度數(shù) 和各稀釋度平均菌落數(shù)之稀釋度間菌落平均數(shù) = 注意事項(xiàng) （ 1）嚴(yán)格無(wú)菌操作，防止污染。 （ 2）認(rèn)真檢查試驗(yàn)器材有無(wú)破損（要 特別注意試管底的裂痕和破洞），以防丟失樣本和污染環(huán)境。 （ 3）注意菌液的均勻分散。 （ 4）稀釋或取液時(shí)要準(zhǔn)確，盡量減少吸管使用中產(chǎn)生的誤差。 （ 5）每吸取一個(gè)稀釋度樣液，必須更換一支吸管，以減少誤差。 （ 6）樣液接種于平皿后應(yīng)盡快傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，避免樣液干燥于平皿上，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。 （ 7）傾注時(shí)瓊脂培養(yǎng)基溫度不得超過(guò) 45℃ ，以防損傷細(xì)菌或真菌。傾注和搖動(dòng)時(shí)，動(dòng)作應(yīng)盡量平穩(wěn)，以利細(xì)菌分散均勻，便于計(jì)數(shù)菌落。勿使培養(yǎng)基外溢，以免影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和造成環(huán)境的污染。 （ 8）為提高試驗(yàn)成功率，最好先用濁度計(jì)對(duì) 原菌液含菌量做出估計(jì)，盡可能在首次試驗(yàn)時(shí)所取的有限稀釋范圍內(nèi)（ 2個(gè) ～ 3個(gè) 稀釋度）即有長(zhǎng)菌在 15cfu～ 300cfu 之 間的平板。 — 35— （ 9）結(jié)果計(jì)算時(shí)，必須弄清稀釋倍數(shù)，以免計(jì)算錯(cuò)誤。 殘留消毒劑的去除方法 目 的 在化學(xué)消毒試驗(yàn)中，達(dá)到規(guī)定消毒時(shí)間終點(diǎn)時(shí)，要求立即終止殘留消毒劑的繼續(xù)作用，以便準(zhǔn)確檢測(cè)出消毒體系中殘留存活的微生物及其數(shù)量。因?yàn)橄倔w系中殘留的消毒劑，可能對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖具有一定抑制作用，從而可導(dǎo)致對(duì)殺菌效果偏高的錯(cuò)誤判斷，甚至產(chǎn)生假陰性結(jié)果。殘留消 毒劑的去除（下簡(jiǎn)稱(chēng)除藥），可排除殘留消毒劑對(duì)微生物的抑制，從而使試驗(yàn)獲得正確結(jié)果。 除藥的原則 （ 1）可有效去除殘留的消毒劑。 （ 2）對(duì)微生物無(wú)害，不減少微生物應(yīng)有的回收量。 （ 3）不破壞培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成份，不影響其透明度。 （ 4）必須按規(guī)定方法進(jìn)行鑒定試驗(yàn)，并認(rèn)為合格者方可在相應(yīng)的消毒試驗(yàn)中使用。 除藥的方法 （ 1）化學(xué)中和法：又稱(chēng)中和劑法，是指在消毒劑與微生物作用到達(dá)規(guī)定時(shí)間的終點(diǎn)時(shí)，取樣加于適宜種類(lèi)和濃度的中和劑中，將殘留消毒劑迅速中和，使其不再持續(xù)抑制或殺滅微生 物的方法。本法同時(shí)含有稀釋作用效果（至少 1:1稀釋?zhuān)Ｓ?1:10稀釋?zhuān)?， 是最為普遍使用的方法。 對(duì)常用消毒劑，雖有一些中和劑介紹，但在實(shí)際應(yīng)用中由于情況多變，效果不一定都理想。所以，在消毒試驗(yàn)前仍應(yīng)將擬用中和劑按試驗(yàn)具體情況，經(jīng)鑒定合格后再使用。 操作要點(diǎn)： ① 對(duì)接觸消毒劑的微生物樣本，在達(dá)到規(guī)定作用時(shí)間，即刻取樣移入鑒定合格的中和劑溶液中； ② 所用中和劑的濃度與容量應(yīng)與鑒定試驗(yàn)結(jié)果規(guī)定的相同； ③ 即刻混勻，并按規(guī)定時(shí)間吸取樣液進(jìn)行隨后的培養(yǎng)檢測(cè)； ④ 在將樣本接種培養(yǎng)基以前的操作，應(yīng)按規(guī)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行，以免微生物與中 和劑或中和產(chǎn)物接觸過(guò)久。 （ 2）過(guò)濾沖洗法 將經(jīng)消毒劑作用過(guò)的微生物樣本，立即加入適量稀釋液中混勻（通過(guò)適量稀釋?zhuān)蓽p輕消毒劑的持續(xù)作用），并傾入裝有微孔濾膜的濾器內(nèi)，接真空泵抽吸過(guò)濾（或加壓過(guò)濾）后，再加適量稀釋液沖洗，同時(shí)過(guò)濾，可去除殘留的消毒劑。多用于難以找到適宜中和劑的消毒劑試驗(yàn)中，如以植物提取物制備的消毒劑。本除藥方法應(yīng)按擬進(jìn)行試驗(yàn)具體情況，經(jīng)鑒定合格后再使用。 操作要點(diǎn)： ① 準(zhǔn)備好裝有相應(yīng)孔徑微孔濾膜的濾器； ② 濾膜及濾器需先經(jīng)滅菌處理； ③ 初次過(guò)濾后，應(yīng)使用一定量對(duì)微生物無(wú)害的稀釋液進(jìn)行沖洗，沖洗次 數(shù)一般以洗凈消毒劑為準(zhǔn)； ④ 最后一次沖洗、濾凈后，將微孔濾膜以無(wú)菌操作法取出，進(jìn)行隨后的培養(yǎng)檢測(cè)。 （ 3）稀釋法 將經(jīng)消毒劑作用過(guò)的微生物樣本，用稀釋液稀釋?zhuān)档蜌埩粝?— 36— 劑濃度，以消除對(duì)微生物的抑制作用。但若稀釋過(guò)多，微生物濃度下降，可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。本法可單獨(dú)使用，但更常見(jiàn)的是與其它方法同時(shí)使用。單獨(dú)使用時(shí)，一般多用于濃度系數(shù)較高的消毒劑（如醇類(lèi)消毒劑）。本法應(yīng)按擬進(jìn)行試驗(yàn)具體情況，經(jīng)鑒定合格后再使用。 操作要點(diǎn)： ① 對(duì)接觸消毒劑的微生物樣本，在達(dá)到規(guī)定作用時(shí)間后，即時(shí)以對(duì)微生物無(wú)害的稀釋液稀釋?zhuān)♂尡壤S試 驗(yàn)需要決定； ② 電動(dòng) 混合或敲打振蕩，使之混勻； ③ 吸取稀釋樣液進(jìn)行隨后培養(yǎng)檢測(cè)。 注意事項(xiàng) （ 1）處理時(shí)應(yīng)嚴(yán)守?zé)o菌操作要求，所有試液須無(wú)菌，接觸樣本和試液的器材（如吸管、平皿、試管、濾材等）亦均須經(jīng)滅菌，以免污染樣本，影響試驗(yàn)結(jié)果。 （ 2）每次吸液，均須更換一支無(wú)菌吸管，以防交叉污