【正文】 驗(yàn)分組，準(zhǔn)備足量試管和平皿，依次進(jìn)行編號(hào)。將消毒劑按所需濃度配制好后，置20℃177。1℃水浴中待用。，制成含有機(jī)干擾物質(zhì)的菌懸液，置20℃177。1℃水浴中備用。（1）第 1 組。，置20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，混勻。作用至預(yù)定時(shí)間，吸此樣液 加于含有 稀釋液的試管中，混勻。，接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（2）第2組。，置 20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，混勻。作用至預(yù)定時(shí)間，吸此樣液 加于含 中和劑溶液管中，混勻，作用10min。，接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。如平板生長(zhǎng)菌落數(shù)均超過(guò) 300 個(gè)，應(yīng)以稀釋液對(duì)上述最終樣液作適宜稀釋后，再次進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（3）第 3 組。，置 20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，混勻。，作用10min。用中和劑做10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，各吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（4）第 4 組。，置 20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，（，作用 10min 配制而成）于試管內(nèi)，混勻。作用10min，吸取該最終樣液 ，用中和產(chǎn)物溶液做 10 倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，各吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（5）第5組。，置20℃177。1℃ 水浴中5min 后，混勻。，作用 10min ，用稀釋液做10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，各吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（6）第 6 組。分別吸取稀釋液、倒入上述試驗(yàn)同批次的培養(yǎng)基25ml，培養(yǎng)觀察。如出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)，可能提示試驗(yàn)材料或操作過(guò)程中有污染。應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)。 中和劑載體定量鑒定試驗(yàn)操作程序根據(jù)試驗(yàn)分組，準(zhǔn)備足量試管和平皿，依次進(jìn)行編號(hào)。各組分別用適宜大小容量的無(wú)菌定量吸管按以下程序吸取或添加試劑和試驗(yàn)樣本。（1）第1組。，將其置20℃177。1℃水浴中5min后，用無(wú)菌鑷子夾入一菌片，并使浸透于消毒液中。待作用至試驗(yàn)預(yù)定的時(shí)間，作用10min。用電動(dòng)混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?0次，吸取該最終樣液 ，接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（2）第 2 組。吸取消毒劑 于無(wú)菌小平皿內(nèi)，將其置 20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，用無(wú)菌鑷子夾入一菌片，并使浸透于消毒液中，待作用至試驗(yàn)預(yù)定時(shí)間，立即用無(wú)菌鑷子取出菌片移入含 中和劑試管中，用電動(dòng)混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?0 次。作用10min，分別接種于各平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。如平板生長(zhǎng)菌落數(shù)均超過(guò) 300個(gè)， 應(yīng)重新吸取該最終樣液 ，用稀釋液做適當(dāng)稀釋，選適宜稀釋度懸液，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（3）第 3 組。吸取中和劑 于無(wú)菌小平皿中，將其置 20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，用無(wú)菌鑷子夾入 1 菌片，并使浸透于中和劑內(nèi)，作用 10min。 ml 中和劑試管中，用電動(dòng)混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?0 次，混勻。吸取該最終樣液 ，用中和劑做 10 倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（4）第 4 組。 吸取中和產(chǎn)物溶液 （以一片浸有消毒劑的載體置 中和劑內(nèi)，作用10min） 于無(wú)菌小平皿內(nèi)，將其置 20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，用無(wú)菌鑷子夾入 1 菌片，并使浸透于中和產(chǎn)物溶液中。作用 10min，用無(wú)菌鑷子取出菌片，移入含 中和產(chǎn)物溶液的試管中，用電動(dòng)混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?80 次，混勻。，用中和產(chǎn)物溶液做10 倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（5）第 5 組。吸取稀釋液 于無(wú)菌小平皿內(nèi)，將其置 20℃177。1℃ 水浴中 5min 后， 用無(wú)菌鑷子夾入 1 菌片，并使浸透于稀釋液中。作用10min，立即用無(wú)菌鑷子取出菌片移入含 稀釋液的試管中，用電動(dòng)混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?80 次，混勻。，用稀釋液 做10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（6）第 6 組。，倒入上述試驗(yàn)同批次的培養(yǎng)基15ml～20ml，培養(yǎng)觀察。如出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)，提示試驗(yàn)材料或操作過(guò)程中可能有污染。應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)。 評(píng)價(jià)規(guī)定試驗(yàn)結(jié)果符合以下全部條件，所測(cè)中和劑可判為合格:（1） 第 1 組無(wú)試驗(yàn)菌，或僅有極少數(shù)試驗(yàn)菌菌落生長(zhǎng)。（2） 第 2 組有較第 1 組為多，但較第 5（組）為少的試驗(yàn)菌菌落生長(zhǎng)，并符合表 21 要求者。表 21 中和劑鑒定試驗(yàn)合格標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)第 1 組與第 2 組菌落數(shù)的要求第 1 組平板平均菌落數(shù)第 2 組平板平均菌落數(shù)05X（1～10）（X + 5）Y（10）（Y + Y）注：對(duì)抑菌作用不明顯消毒劑（如乙醇）所用中和劑的鑒定試驗(yàn)中，當(dāng)?shù)?1 組與第 2 組菌落數(shù)相近，難以達(dá)到本表要求時(shí)，可根據(jù)具體情況另行作出判斷和評(píng)價(jià)。（3） 第 5（組）有相似量試驗(yàn)菌生長(zhǎng)，懸液試驗(yàn)在1107 cfu/ml～5107 cfu/ml之間，載體試驗(yàn)在 5105 cfu/片～5106 cfu/片 之間。其組間菌落數(shù)誤差率應(yīng)不超過(guò) 15%。第5 組間菌落數(shù)誤差率計(jì)算公式其計(jì)算公式如下。（4）第6組無(wú)菌生長(zhǎng)。否則，說(shuō)明試劑有污染，應(yīng)更換無(wú)污染的試劑重新進(jìn)行試驗(yàn)。（5）連續(xù) 3 次試驗(yàn)取得合格評(píng)價(jià)。 注意事項(xiàng)（1）試驗(yàn)所分各組均有其特定意義，不得任意刪減。（2）嚴(yán)守?zé)o菌操作，保持試液和器材的無(wú)菌，注意更換吸管，以防止沾染影響試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。（3）在計(jì)算微生物濃度時(shí)，須考慮其稀釋倍數(shù)。（4）試驗(yàn)組序應(yīng)按本規(guī)范所列排列。 物理法去除殘留消毒劑試驗(yàn) 目 的 通過(guò)本鑒定試驗(yàn)，確定常用的物理去除法是否可去除消毒體系中殘留的消毒劑，使消毒劑鑒定試驗(yàn)顯示出真正的殺菌效果。 試驗(yàn)器材（1）過(guò)濾沖洗法需用經(jīng)過(guò)滅菌處理的濾器、微孔濾膜、真空泵（或抽濾泵）。（2）離心沉淀法需用離心機(jī)與離心管。（3）吸附柱、分子篩柱（主要供病毒滅活試驗(yàn)用）。（4）無(wú)菌稀釋液、沖洗液。要求不應(yīng)影響除藥材料（如濾膜、吸附柱等）的性質(zhì)，對(duì)微生物無(wú)傷害作用。常用的有：水、緩沖液（如PBS）、稀釋液、%～%吐溫80的PBS、中和劑（可中和部分消毒成分）。（5）其他器材隨所用試驗(yàn)微生物而定。 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則（1）通過(guò)所設(shè)各組試驗(yàn)結(jié)果綜合分析，應(yīng)可確定所選方法是否對(duì)測(cè)試消毒劑有良好的去除作用，對(duì)試驗(yàn)用微生物以及其恢復(fù)期培養(yǎng)是否有害或不良影響。（2）試驗(yàn)中所用消毒劑的濃度應(yīng)以殺菌試驗(yàn)中使用的最高濃度為準(zhǔn)。濃度過(guò)低不足以顯示能否將高濃度消毒劑全部去除。（3）鑒定試驗(yàn)中，消毒后去除殘留消毒劑組無(wú)微生物生長(zhǎng)，不能表明去除處理后細(xì)菌是否復(fù)蘇。此時(shí)可增加處理時(shí)間或次數(shù)，亦可適當(dāng)縮短作用時(shí)間再試。作用時(shí)間最短不得少于30s，否則難以控制試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。（4）同一消毒劑擬對(duì)多種微生物進(jìn)行殺滅試驗(yàn)時(shí)，所用物理去除消毒劑法應(yīng)按微生物種類分別進(jìn)行鑒定試驗(yàn)，不得互相取代。對(duì)細(xì)菌繁殖體的試驗(yàn)，可在大腸桿菌（8099）、銅綠假單胞菌（ATCC 15442）或金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）中任選其一進(jìn)行試驗(yàn)即可；對(duì)細(xì)菌芽孢，以枯草桿菌黑色變種（ATCC 9372）芽孢進(jìn)行。當(dāng)用其他特定微生物 （如龜分枝桿菌膿腫亞種） 進(jìn)行殺滅試驗(yàn)時(shí)，均應(yīng)以該特定微生物再次進(jìn)行去除消毒劑方法的鑒定試驗(yàn)。（5）鑒定中應(yīng)根據(jù)正式殺滅試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，選擇使用懸液定量試驗(yàn)，還是載體定量試驗(yàn)。通常，懸液鑒定試驗(yàn)結(jié)果可用于載體試驗(yàn)。 物理去除方法的鑒定（1）分組方法如下：1）消毒劑 + 菌懸液 → 培養(yǎng)觀察消毒劑對(duì)試驗(yàn)菌有無(wú)殺滅或抑制作用。2）（菌懸液 + 消毒劑） + 過(guò)濾沖洗法處理 → 培養(yǎng)觀察所用去除消毒劑處理后，受到消毒劑作用后的試驗(yàn)菌是否能恢復(fù)生長(zhǎng)。3）（菌懸液 + 水） ＋過(guò)濾沖洗法處理 → 培養(yǎng)觀察去除消毒劑處理是否影響試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)數(shù)量。4）菌懸液 → 培養(yǎng) 作為菌懸液陽(yáng)性對(duì)照值。（2）操作程序如下：1） 第 1 組。，混勻后，置20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，（應(yīng)先置 20℃177。1℃中水?。┯谠嚬軆?nèi)，混勻，作用至試驗(yàn)預(yù)定時(shí)間。， 稀釋液試管中，混勻。吸取最終樣液 接種于平皿內(nèi)，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。2） 第 2 組。，混勻后，置20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，混勻。作用至試驗(yàn)預(yù)定時(shí)間，對(duì)其進(jìn)行去除消毒劑處理，并取最終樣液 接種于平皿內(nèi)，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)（如為濾膜法，可直接將濾膜有菌面朝上貼于平板表面）。如平皿生長(zhǎng)菌落數(shù)均超過(guò)300 個(gè)，應(yīng)再吸取該最終樣液 ，用 PBS 做適當(dāng)稀釋，選擇適宜稀釋度懸液，吸取 ，分別接種于平皿內(nèi)，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。3） 第 3 組。，混勻后，置20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，混勻。不加消毒劑，做同上處理。取最終樣液 ml 用稀釋液做 10 倍系列稀釋，選擇 2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度懸液，各取 ，分別接種于平皿內(nèi)，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)（如為濾膜法，可先進(jìn)行10 倍系列稀釋，再經(jīng)過(guò)濾沖洗法處理，然后直接將濾膜有菌面朝上貼于平板表面）。4） 第 4 組。吸取試驗(yàn)菌懸液 ，置含 ml 稀釋液的試管中，不加消毒劑，亦不作任何去除處理，進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)，作為陽(yáng)性對(duì)照值。（3） 評(píng)價(jià)規(guī)定試驗(yàn)結(jié)果符合以下全部條件，所測(cè)中和劑可判為合格:1） 第 1 組無(wú)試驗(yàn)菌，或僅有極少數(shù)生長(zhǎng)。2） 第 2 組有遠(yuǎn)較第 1 組為多，但較第 4（組）為少的試驗(yàn)菌生長(zhǎng)。在第 1 組無(wú)菌生長(zhǎng)時(shí)，第 2 組平均每個(gè)平板 （或?yàn)V膜） 上生長(zhǎng)菌落不少于 5 個(gè)。3） 第 4 （組）測(cè)定的結(jié)果，微生物數(shù)量應(yīng)在 1107 cfu/ml～5107 cfu/ml 之間，其組間差不得超過(guò)兩組回收菌數(shù)平均值的50%。組間差的計(jì)算可按下式進(jìn)行:4）連續(xù) 3 次試驗(yàn)取得合格評(píng)價(jià)。5）本規(guī)范推薦使用過(guò)濾沖洗法。 注意事項(xiàng) 見(jiàn) 。 細(xì)菌定量殺滅試驗(yàn) 目 的 在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)測(cè)定消毒劑殺滅懸液中或載體上細(xì)菌繁殖體和細(xì)菌芽孢所需劑量，以驗(yàn)證實(shí)用消毒劑量。 試驗(yàn)器材（1）按 所示方法制備的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和枯草桿菌黑色變種芽孢懸液或菌片。此外，根據(jù)消毒劑特定用途或試驗(yàn)特殊需要，準(zhǔn)備其他菌種的懸液或菌片。（2）消毒劑溶液除有特殊規(guī)定者外，應(yīng)使用無(wú)菌硬水配制。消毒劑溶液濃度應(yīng)以所含有效成份為準(zhǔn)。例如，含氯消毒劑以所含有效氯濃度為準(zhǔn)，碘伏以所含有效碘為準(zhǔn)，過(guò)氧乙酸以所含過(guò)氧乙酸量為準(zhǔn)，復(fù)方消毒劑濃度以主要?dú)⒕行С煞趾繛闇?zhǔn)。各組消毒劑溶液有效成份濃度的計(jì)算，應(yīng)以試驗(yàn)菌與消毒劑的混合液中有效成份的最終濃度為準(zhǔn)。（3）去除殘留消毒劑的中和劑或設(shè)備 （經(jīng)鑒定試驗(yàn)證實(shí)合格的中和劑或有關(guān)器材）。（4）消毒劑稀釋用硬水：見(jiàn)附錄A。（5）有機(jī)干擾物質(zhì)。懸液試驗(yàn)用3%BSA溶液，載體試驗(yàn)直接用TSB(見(jiàn)附錄A)。（6）TSA培養(yǎng)基：見(jiàn)附錄A。（7）含中和劑的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（中和劑TSB），中和劑經(jīng)鑒定合格。（8）刻度吸管 （、）。（9）恒溫水浴箱。（10）噴霧器（用于噴霧消毒試驗(yàn)）。（11）電動(dòng)混合器。（12）秒表。 試驗(yàn)分組試驗(yàn)中應(yīng)分以下各組：（1）試驗(yàn)組。按測(cè)試目的有兩種選擇。第一種適用于消毒產(chǎn)品鑒定。根據(jù)本規(guī)范中表11和使用說(shuō)明書(shū)，選定試驗(yàn)菌和一個(gè)消毒劑濃度（即產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)中指定的最低濃度）以及3個(gè)作用時(shí)間（說(shuō)明書(shū)指定最短作用時(shí)間。如說(shuō)明書(shū)指定最短作用時(shí)間為20min，則應(yīng)進(jìn)行10min、20min、30min 三個(gè)時(shí)間）進(jìn)行試驗(yàn)。第二種適用于消毒產(chǎn)品監(jiān)督機(jī)構(gòu)日常監(jiān)測(cè)。根據(jù)所試菌種和消毒劑對(duì)該菌的殺滅能力，選定一株抗力較強(qiáng)的菌和一個(gè)消毒劑濃度（即產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)中指定的最低濃度）以及一個(gè)作用時(shí)間（說(shuō)明書(shū)指定最短作用時(shí)間）進(jìn)行試驗(yàn)。（2）陽(yáng)性對(duì)照組。根據(jù)各種試驗(yàn)的規(guī)定，用稀釋液代替消毒劑溶液，按上述同樣的步驟進(jìn)行試驗(yàn)。所得結(jié)果代表菌液原有濃度，以其作為計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)的初始濃度。 懸液定量殺菌試驗(yàn)操作程序（1）首先按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)要求配制消毒液。無(wú)特殊說(shuō)明者，一律使用無(wú)菌硬水配制，（例如要評(píng)價(jià)的消毒液濃度為200mg/L，則應(yīng)配制250mg/L），置20℃177。1℃ 水浴備用。（2） 配制實(shí)驗(yàn)用菌懸液，濃度為1108cfu/ml～5108cfu/ml。（3）取消毒試驗(yàn)用無(wú)菌大試管，，混勻，置 20℃177。1℃ 水浴中 5min后，用無(wú)菌吸管吸取上述濃度消毒液 ml 注入其中，迅速混勻并立即記時(shí)。（4）待試驗(yàn)菌與消毒劑相互作用至各預(yù)定時(shí)間， 經(jīng)滅菌的中和劑中，混勻。（5）各管試驗(yàn)菌與消毒劑混合液經(jīng)加中和劑作用 10min 后，分別吸取 ，按活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法測(cè)定存活菌數(shù)，每管樣液接種 2 個(gè)平皿即可。如平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)較多時(shí)，可進(jìn)行系列10倍稀釋后，再進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（6）同時(shí)用稀釋液代替消毒液，進(jìn)行平行試驗(yàn)，作為陽(yáng)性對(duì)照。（7）所有試驗(yàn)樣本均在 37℃ 溫箱中培養(yǎng)，對(duì)細(xì)菌繁殖體培養(yǎng)48h 觀察最終結(jié)果；對(duì)細(xì)菌芽孢需培養(yǎng) 72h 觀察最終結(jié)果。（8）試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算各組的活菌濃度（cfu/ml），并換算為對(duì)數(shù)值（N），然后按下式計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值:殺滅對(duì)數(shù)值 (KL)＝對(duì)照組平均活菌濃度的對(duì)數(shù)值（No）－試驗(yàn)組活菌濃度對(duì)數(shù)值（Nx）計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值時(shí)，取小數(shù)點(diǎn)后兩位值，可以進(jìn)行數(shù)字修約。如果消毒試驗(yàn)組消毒處理后平均生產(chǎn)菌落數(shù)，小于等于1時(shí)，其殺滅對(duì)數(shù)值，即大于等于試驗(yàn)前對(duì)照組平均活菌濃度的對(duì)數(shù)值。 載體浸泡殺菌試驗(yàn)操作程序（1）載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)操作程序1）取無(wú)菌小平皿，標(biāo)明所注入消毒液的濃度。按每片 的量，吸取相應(yīng)濃度的消毒劑溶液注入平皿中。2）將盛有消毒劑平皿置 20℃177。1℃ 水浴箱內(nèi) 5min 后，用無(wú)菌鑷子分別放入預(yù)先制備的菌片 3 片，并使之浸透于消毒液中。3）待菌藥相互作用至各預(yù)定時(shí)間，用無(wú)菌鑷子將菌片取出分別移入一含 中和劑試管中。用電動(dòng)混合器混合20s，或?qū)⒃嚬茉谑终粕险袂?80 次，使菌片上的細(xì)菌被洗脫進(jìn)入中和液中，再放置5min以上，使中和