【正文】 驗分組，準備足量試管和平皿，依次進行編號。將消毒劑按所需濃度配制好后，置20℃177。1℃水浴中待用。，制成含有機干擾物質(zhì)的菌懸液，置20℃177。1℃水浴中備用。（1）第 1 組。，置20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，混勻。作用至預(yù)定時間，吸此樣液 加于含有 稀釋液的試管中，混勻。，接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。（2）第2組。，置 20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，混勻。作用至預(yù)定時間，吸此樣液 加于含 中和劑溶液管中，混勻，作用10min。，接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。如平板生長菌落數(shù)均超過 300 個，應(yīng)以稀釋液對上述最終樣液作適宜稀釋后，再次進行活菌培養(yǎng)計數(shù)。（3）第 3 組。，置 20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，混勻。，作用10min。用中和劑做10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，各吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。（4）第 4 組。，置 20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，（，作用 10min 配制而成）于試管內(nèi)，混勻。作用10min，吸取該最終樣液 ，用中和產(chǎn)物溶液做 10 倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，各吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。（5）第5組。，置20℃177。1℃ 水浴中5min 后，混勻。，作用 10min ，用稀釋液做10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，各吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。（6）第 6 組。分別吸取稀釋液、倒入上述試驗同批次的培養(yǎng)基25ml，培養(yǎng)觀察。如出現(xiàn)細菌生長，可能提示試驗材料或操作過程中有污染。應(yīng)重新進行試驗。 中和劑載體定量鑒定試驗操作程序根據(jù)試驗分組，準備足量試管和平皿，依次進行編號。各組分別用適宜大小容量的無菌定量吸管按以下程序吸取或添加試劑和試驗樣本。（1）第1組。，將其置20℃177。1℃水浴中5min后，用無菌鑷子夾入一菌片，并使浸透于消毒液中。待作用至試驗預(yù)定的時間，作用10min。用電動混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?0次，吸取該最終樣液 ，接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。（2）第 2 組。吸取消毒劑 于無菌小平皿內(nèi)，將其置 20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，用無菌鑷子夾入一菌片，并使浸透于消毒液中，待作用至試驗預(yù)定時間，立即用無菌鑷子取出菌片移入含 中和劑試管中，用電動混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?0 次。作用10min，分別接種于各平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。如平板生長菌落數(shù)均超過 300個， 應(yīng)重新吸取該最終樣液 ，用稀釋液做適當稀釋，選適宜稀釋度懸液，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。（3）第 3 組。吸取中和劑 于無菌小平皿中，將其置 20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，用無菌鑷子夾入 1 菌片，并使浸透于中和劑內(nèi)，作用 10min。 ml 中和劑試管中，用電動混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?0 次，混勻。吸取該最終樣液 ，用中和劑做 10 倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。（4）第 4 組。 吸取中和產(chǎn)物溶液 （以一片浸有消毒劑的載體置 中和劑內(nèi)，作用10min） 于無菌小平皿內(nèi)，將其置 20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，用無菌鑷子夾入 1 菌片，并使浸透于中和產(chǎn)物溶液中。作用 10min，用無菌鑷子取出菌片，移入含 中和產(chǎn)物溶液的試管中，用電動混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?80 次，混勻。，用中和產(chǎn)物溶液做10 倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。（5）第 5 組。吸取稀釋液 于無菌小平皿內(nèi)，將其置 20℃177。1℃ 水浴中 5min 后， 用無菌鑷子夾入 1 菌片，并使浸透于稀釋液中。作用10min，立即用無菌鑷子取出菌片移入含 稀釋液的試管中，用電動混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?80 次，混勻。，用稀釋液 做10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。（6）第 6 組。，倒入上述試驗同批次的培養(yǎng)基15ml～20ml，培養(yǎng)觀察。如出現(xiàn)細菌生長，提示試驗材料或操作過程中可能有污染。應(yīng)重新進行試驗。 評價規(guī)定試驗結(jié)果符合以下全部條件，所測中和劑可判為合格:（1） 第 1 組無試驗菌，或僅有極少數(shù)試驗菌菌落生長。（2） 第 2 組有較第 1 組為多，但較第 5（組）為少的試驗菌菌落生長，并符合表 21 要求者。表 21 中和劑鑒定試驗合格標準中對第 1 組與第 2 組菌落數(shù)的要求第 1 組平板平均菌落數(shù)第 2 組平板平均菌落數(shù)05X（1～10）（X + 5）Y（10）（Y + Y）注：對抑菌作用不明顯消毒劑（如乙醇）所用中和劑的鑒定試驗中，當?shù)?1 組與第 2 組菌落數(shù)相近，難以達到本表要求時，可根據(jù)具體情況另行作出判斷和評價。（3） 第 5（組）有相似量試驗菌生長，懸液試驗在1107 cfu/ml～5107 cfu/ml之間，載體試驗在 5105 cfu/片～5106 cfu/片 之間。其組間菌落數(shù)誤差率應(yīng)不超過 15%。第5 組間菌落數(shù)誤差率計算公式其計算公式如下。（4）第6組無菌生長。否則，說明試劑有污染，應(yīng)更換無污染的試劑重新進行試驗。（5）連續(xù) 3 次試驗取得合格評價。 注意事項（1）試驗所分各組均有其特定意義，不得任意刪減。（2）嚴守無菌操作，保持試液和器材的無菌，注意更換吸管，以防止沾染影響試驗的準確性。（3）在計算微生物濃度時，須考慮其稀釋倍數(shù)。（4）試驗組序應(yīng)按本規(guī)范所列排列。 物理法去除殘留消毒劑試驗 目 的 通過本鑒定試驗，確定常用的物理去除法是否可去除消毒體系中殘留的消毒劑，使消毒劑鑒定試驗顯示出真正的殺菌效果。 試驗器材（1）過濾沖洗法需用經(jīng)過滅菌處理的濾器、微孔濾膜、真空泵（或抽濾泵）。（2）離心沉淀法需用離心機與離心管。（3）吸附柱、分子篩柱（主要供病毒滅活試驗用）。（4）無菌稀釋液、沖洗液。要求不應(yīng)影響除藥材料（如濾膜、吸附柱等）的性質(zhì)，對微生物無傷害作用。常用的有：水、緩沖液（如PBS）、稀釋液、%～%吐溫80的PBS、中和劑（可中和部分消毒成分）。（5）其他器材隨所用試驗微生物而定。 試驗設(shè)計原則（1）通過所設(shè)各組試驗結(jié)果綜合分析，應(yīng)可確定所選方法是否對測試消毒劑有良好的去除作用，對試驗用微生物以及其恢復(fù)期培養(yǎng)是否有害或不良影響。（2）試驗中所用消毒劑的濃度應(yīng)以殺菌試驗中使用的最高濃度為準。濃度過低不足以顯示能否將高濃度消毒劑全部去除。（3）鑒定試驗中，消毒后去除殘留消毒劑組無微生物生長，不能表明去除處理后細菌是否復(fù)蘇。此時可增加處理時間或次數(shù)，亦可適當縮短作用時間再試。作用時間最短不得少于30s，否則難以控制試驗的準確性。（4）同一消毒劑擬對多種微生物進行殺滅試驗時，所用物理去除消毒劑法應(yīng)按微生物種類分別進行鑒定試驗，不得互相取代。對細菌繁殖體的試驗，可在大腸桿菌（8099）、銅綠假單胞菌（ATCC 15442）或金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）中任選其一進行試驗即可；對細菌芽孢，以枯草桿菌黑色變種（ATCC 9372）芽孢進行。當用其他特定微生物 （如龜分枝桿菌膿腫亞種） 進行殺滅試驗時，均應(yīng)以該特定微生物再次進行去除消毒劑方法的鑒定試驗。（5）鑒定中應(yīng)根據(jù)正式殺滅試驗的設(shè)計，選擇使用懸液定量試驗，還是載體定量試驗。通常，懸液鑒定試驗結(jié)果可用于載體試驗。 物理去除方法的鑒定（1）分組方法如下：1）消毒劑 + 菌懸液 → 培養(yǎng)觀察消毒劑對試驗菌有無殺滅或抑制作用。2）（菌懸液 + 消毒劑） + 過濾沖洗法處理 → 培養(yǎng)觀察所用去除消毒劑處理后，受到消毒劑作用后的試驗菌是否能恢復(fù)生長。3）（菌懸液 + 水） ＋過濾沖洗法處理 → 培養(yǎng)觀察去除消毒劑處理是否影響試驗菌的生長數(shù)量。4）菌懸液 → 培養(yǎng) 作為菌懸液陽性對照值。（2）操作程序如下：1） 第 1 組。，混勻后，置20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，（應(yīng)先置 20℃177。1℃中水?。┯谠嚬軆?nèi)，混勻，作用至試驗預(yù)定時間。， 稀釋液試管中，混勻。吸取最終樣液 接種于平皿內(nèi)，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。2） 第 2 組。，混勻后，置20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，混勻。作用至試驗預(yù)定時間，對其進行去除消毒劑處理，并取最終樣液 接種于平皿內(nèi)，做活菌培養(yǎng)計數(shù)（如為濾膜法，可直接將濾膜有菌面朝上貼于平板表面）。如平皿生長菌落數(shù)均超過300 個，應(yīng)再吸取該最終樣液 ，用 PBS 做適當稀釋，選擇適宜稀釋度懸液，吸取 ，分別接種于平皿內(nèi)，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。3） 第 3 組。，混勻后，置20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，混勻。不加消毒劑，做同上處理。取最終樣液 ml 用稀釋液做 10 倍系列稀釋，選擇 2個～3個適宜稀釋度懸液，各取 ，分別接種于平皿內(nèi)，做活菌培養(yǎng)計數(shù)（如為濾膜法，可先進行10 倍系列稀釋，再經(jīng)過濾沖洗法處理，然后直接將濾膜有菌面朝上貼于平板表面）。4） 第 4 組。吸取試驗菌懸液 ，置含 ml 稀釋液的試管中，不加消毒劑，亦不作任何去除處理，進行活菌培養(yǎng)計數(shù)，作為陽性對照值。（3） 評價規(guī)定試驗結(jié)果符合以下全部條件，所測中和劑可判為合格:1） 第 1 組無試驗菌，或僅有極少數(shù)生長。2） 第 2 組有遠較第 1 組為多，但較第 4（組）為少的試驗菌生長。在第 1 組無菌生長時，第 2 組平均每個平板 （或濾膜） 上生長菌落不少于 5 個。3） 第 4 （組）測定的結(jié)果，微生物數(shù)量應(yīng)在 1107 cfu/ml～5107 cfu/ml 之間，其組間差不得超過兩組回收菌數(shù)平均值的50%。組間差的計算可按下式進行:4）連續(xù) 3 次試驗取得合格評價。5）本規(guī)范推薦使用過濾沖洗法。 注意事項 見 。 細菌定量殺滅試驗 目 的 在實驗室內(nèi)測定消毒劑殺滅懸液中或載體上細菌繁殖體和細菌芽孢所需劑量，以驗證實用消毒劑量。 試驗器材（1）按 所示方法制備的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和枯草桿菌黑色變種芽孢懸液或菌片。此外，根據(jù)消毒劑特定用途或試驗特殊需要，準備其他菌種的懸液或菌片。（2）消毒劑溶液除有特殊規(guī)定者外，應(yīng)使用無菌硬水配制。消毒劑溶液濃度應(yīng)以所含有效成份為準。例如，含氯消毒劑以所含有效氯濃度為準，碘伏以所含有效碘為準，過氧乙酸以所含過氧乙酸量為準，復(fù)方消毒劑濃度以主要殺菌有效成分含量為準。各組消毒劑溶液有效成份濃度的計算，應(yīng)以試驗菌與消毒劑的混合液中有效成份的最終濃度為準。（3）去除殘留消毒劑的中和劑或設(shè)備 （經(jīng)鑒定試驗證實合格的中和劑或有關(guān)器材）。（4）消毒劑稀釋用硬水：見附錄A。（5）有機干擾物質(zhì)。懸液試驗用3%BSA溶液，載體試驗直接用TSB(見附錄A)。（6）TSA培養(yǎng)基：見附錄A。（7）含中和劑的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（中和劑TSB），中和劑經(jīng)鑒定合格。（8）刻度吸管 （、）。（9）恒溫水浴箱。（10）噴霧器（用于噴霧消毒試驗）。（11）電動混合器。（12）秒表。 試驗分組試驗中應(yīng)分以下各組：（1）試驗組。按測試目的有兩種選擇。第一種適用于消毒產(chǎn)品鑒定。根據(jù)本規(guī)范中表11和使用說明書，選定試驗菌和一個消毒劑濃度（即產(chǎn)品使用說明書中指定的最低濃度）以及3個作用時間（說明書指定最短作用時間。如說明書指定最短作用時間為20min，則應(yīng)進行10min、20min、30min 三個時間）進行試驗。第二種適用于消毒產(chǎn)品監(jiān)督機構(gòu)日常監(jiān)測。根據(jù)所試菌種和消毒劑對該菌的殺滅能力，選定一株抗力較強的菌和一個消毒劑濃度（即產(chǎn)品使用說明書中指定的最低濃度）以及一個作用時間（說明書指定最短作用時間）進行試驗。（2）陽性對照組。根據(jù)各種試驗的規(guī)定，用稀釋液代替消毒劑溶液，按上述同樣的步驟進行試驗。所得結(jié)果代表菌液原有濃度，以其作為計算殺滅對數(shù)的初始濃度。 懸液定量殺菌試驗操作程序（1）首先按產(chǎn)品說明書要求配制消毒液。無特殊說明者，一律使用無菌硬水配制，（例如要評價的消毒液濃度為200mg/L，則應(yīng)配制250mg/L），置20℃177。1℃ 水浴備用。（2） 配制實驗用菌懸液，濃度為1108cfu/ml～5108cfu/ml。（3）取消毒試驗用無菌大試管，，混勻，置 20℃177。1℃ 水浴中 5min后，用無菌吸管吸取上述濃度消毒液 ml 注入其中，迅速混勻并立即記時。（4）待試驗菌與消毒劑相互作用至各預(yù)定時間， 經(jīng)滅菌的中和劑中，混勻。（5）各管試驗菌與消毒劑混合液經(jīng)加中和劑作用 10min 后，分別吸取 ，按活菌培養(yǎng)計數(shù)方法測定存活菌數(shù)，每管樣液接種 2 個平皿即可。如平板上生長的菌落數(shù)較多時，可進行系列10倍稀釋后，再進行活菌培養(yǎng)計數(shù)。（6）同時用稀釋液代替消毒液，進行平行試驗，作為陽性對照。（7）所有試驗樣本均在 37℃ 溫箱中培養(yǎng)，對細菌繁殖體培養(yǎng)48h 觀察最終結(jié)果；對細菌芽孢需培養(yǎng) 72h 觀察最終結(jié)果。（8）試驗重復(fù)3次，計算各組的活菌濃度（cfu/ml），并換算為對數(shù)值（N），然后按下式計算殺滅對數(shù)值:殺滅對數(shù)值 (KL)＝對照組平均活菌濃度的對數(shù)值（No）－試驗組活菌濃度對數(shù)值（Nx）計算殺滅對數(shù)值時，取小數(shù)點后兩位值，可以進行數(shù)字修約。如果消毒試驗組消毒處理后平均生產(chǎn)菌落數(shù)，小于等于1時，其殺滅對數(shù)值，即大于等于試驗前對照組平均活菌濃度的對數(shù)值。 載體浸泡殺菌試驗操作程序（1）載體浸泡定量殺菌試驗操作程序1）取無菌小平皿，標明所注入消毒液的濃度。按每片 的量，吸取相應(yīng)濃度的消毒劑溶液注入平皿中。2）將盛有消毒劑平皿置 20℃177。1℃ 水浴箱內(nèi) 5min 后，用無菌鑷子分別放入預(yù)先制備的菌片 3 片，并使之浸透于消毒液中。3）待菌藥相互作用至各預(yù)定時間，用無菌鑷子將菌片取出分別移入一含 中和劑試管中。用電動混合器混合20s，或?qū)⒃嚬茉谑终粕险袂?80 次，使菌片上的細菌被洗脫進入中和液中，再放置5min以上，使中和