【正文】 單獨使用時，一般多用于濃度系數(shù)較高的消毒劑（如醇類消毒劑）。本法應按擬進行試驗具體情況，經(jīng)鑒定合格后再使用。操作要點：①對接觸消毒劑的微生物樣本，在達到規(guī)定作用時間后，即時以對微生物無害的稀釋液稀釋，稀釋比例隨試驗需要決定；②電動混合或敲打振蕩，使之混勻；③吸取稀釋樣液進行隨后培養(yǎng)檢測。 注意事項（1）處理時應嚴守無菌操作要求，所有試液須無菌，接觸樣本和試液的器材（如吸管、平皿、試管、濾材等）亦均須經(jīng)滅菌，以免污染樣本，影響試驗結(jié)果。（2）每次吸液，均須更換一支無菌吸管，以防交叉污染。此點由于操作繁瑣，器材需求量大，往往不能認真執(zhí)行，應加以注意。（3）為保證試驗的準確性，所用吸管的容量應盡量與擬吸取的液體量相近，不要用大吸管吸取少量液體；試驗樣本的混勻操作，必須認真進行；盡量減少中和劑或中和產(chǎn)物與試驗微生物的接觸時間。（4）所用方法適宜與否，和消毒劑性質(zhì)、復方中的附加成份、試驗微生物種類、消毒試驗種類等等均有關(guān)系，試驗條件稍有改變就可能影響除藥效果。故每進行一種消毒試驗（包括消毒劑或微生物的更換），均需按規(guī)定對所選方法進行鑒定試驗，合格者方可用于正式試驗。此步驟絕不可省略，否則極有可能導致試驗產(chǎn)生錯誤結(jié)果。 中和劑鑒定試驗 目 的確定所選中和劑是否適用于擬進行的細菌和真菌殺滅試驗。 試驗器材（1）試驗菌菌懸液和菌片（見 ）。（2）刻度吸管（、）。（3）小平皿（4 cm～6cm 直徑）。（4）恒溫水浴箱。（5）稀釋液：見附錄A。（6）胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）：見附錄A。（7）電動混合器 試驗設計原則（1）通過所設各組試驗結(jié)果綜合分析，應可確定所用中和劑是否對測試消毒劑有良好的中和作用，對試驗用細菌以及其恢復期培養(yǎng)是否有害或不良影響。（2）在確定用何種中和劑進行鑒定試驗有困難時，可對多個中和劑進行初選以確定（見本款文后【附】）。（3）試驗中所用消毒劑的濃度應以殺菌試驗中使用的最高濃度為準。濃度過低，則不足以顯示能否將高濃度消毒劑全部中和。（4）鑒定試驗中，消毒后去除殘留消毒劑組（第2組）無菌生長，不能表明中和后受到消毒劑作用后的細菌是否能恢復生長。細菌是否復蘇。此時可適當縮短作用時間重新進行試驗，但作用時間最短不得少于30s，否則難以控制試驗的準確性。若縮短作用時間后仍無菌生長，在排除其他原因的基礎(chǔ)上，可適當下調(diào)殺菌試驗中消毒劑濃度，再次進行中和劑鑒定試驗。（5）同一消毒劑擬對多種微生物進行殺滅試驗時，應按微生物種類分別進行鑒定試驗。對細菌繁殖體，在大腸桿菌（8099）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、銅綠假單胞菌（ATCC 15442）中任選其一進行試驗即可；對細菌芽孢，以枯草桿菌黑色變種（ATCC 9372）芽孢進行。當用其他特定微生物進行殺滅試驗時，均應以該特定微生物進行中和劑的鑒定試驗。（6）鑒定時根據(jù)所用殺菌試驗方法，使用相應的懸液或載體定量試驗。【附】中和劑初選試驗中和劑鑒定試驗前，若難確定擬檢測的中和劑，可通過本試驗初選，而后以選中的中和劑進行正式的鑒定試驗。初選操作程序如下：（1） 試驗菌懸液（含菌量為 1103 cfu/ml～3103 cfu/ml）加入含 中和劑試管中，混勻，作用30min后，用TSA傾注法培養(yǎng)。（2） 試驗菌懸液（含菌量為 1103 cfu/ml～3103 cfu/ml）加入含 ，混勻，作用30min后，用TSA傾注法培養(yǎng)。（3）試驗同時設陽性對照組。陽性對照組以 菌懸液加入含 稀釋液試管中，混勻，作用30min后，用TSA傾注法培養(yǎng)。當3組平板上長出的菌落數(shù)接近，如果以陽性對照組為標準（X），前兩組長菌數(shù)為（X177。50%X）以內(nèi)，可進行正式的鑒定試驗。 試驗分組第1組 消毒劑 + 菌懸液 →培養(yǎng)觀察消毒劑對試驗菌有無殺滅或抑制能力。第2組 （消毒劑 + 菌懸液） + 中和劑 → 培養(yǎng)觀察殘留消毒劑被中和后受到清毒劑作用后的試驗菌是否能恢復生長。第3組 中和劑 + 菌懸液 → 培養(yǎng)觀察中和劑是否抑菌。第4組 （消毒劑 + 中和劑）+ 菌液 → 培養(yǎng)觀察中和產(chǎn)物，或未被完全中和的殘留消毒劑對試驗菌的生長繁殖是否有影響。第5組 稀釋液 + 菌懸液 → 培養(yǎng)作為菌數(shù)對照。第6組 稀釋液 + 中和劑 + 培養(yǎng)基 → 培養(yǎng)作為陰性對照。 中和劑懸液定量鑒定試驗操作程序 根據(jù)試驗分組，準備足量試管和平皿，依次進行編號。將消毒劑按所需濃度配制好后，置20℃177。1℃水浴中待用。，制成含有機干擾物質(zhì)的菌懸液，置20℃177。1℃水浴中備用。（1）第 1 組。，置20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，混勻。作用至預定時間，吸此樣液 加于含有 稀釋液的試管中，混勻。，接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。（2）第2組。，置 20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，混勻。作用至預定時間，吸此樣液 加于含 中和劑溶液管中，混勻，作用10min。，接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。如平板生長菌落數(shù)均超過 300 個，應以稀釋液對上述最終樣液作適宜稀釋后，再次進行活菌培養(yǎng)計數(shù)。（3）第 3 組。，置 20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，混勻。，作用10min。用中和劑做10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，各吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。（4）第 4 組。，置 20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，（，作用 10min 配制而成）于試管內(nèi)，混勻。作用10min，吸取該最終樣液 ，用中和產(chǎn)物溶液做 10 倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，各吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。（5）第5組。，置20℃177。1℃ 水浴中5min 后，混勻。，作用 10min ，用稀釋液做10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，各吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。（6）第 6 組。分別吸取稀釋液、倒入上述試驗同批次的培養(yǎng)基25ml，培養(yǎng)觀察。如出現(xiàn)細菌生長，可能提示試驗材料或操作過程中有污染。應重新進行試驗。 中和劑載體定量鑒定試驗操作程序根據(jù)試驗分組，準備足量試管和平皿，依次進行編號。各組分別用適宜大小容量的無菌定量吸管按以下程序吸取或添加試劑和試驗樣本。（1）第1組。，將其置20℃177。1℃水浴中5min后，用無菌鑷子夾入一菌片，并使浸透于消毒液中。待作用至試驗預定的時間，作用10min。用電動混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?0次，吸取該最終樣液 ，接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。（2）第 2 組。吸取消毒劑 于無菌小平皿內(nèi)，將其置 20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，用無菌鑷子夾入一菌片，并使浸透于消毒液中，待作用至試驗預定時間，立即用無菌鑷子取出菌片移入含 中和劑試管中，用電動混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?0 次。作用10min，分別接種于各平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。如平板生長菌落數(shù)均超過 300個， 應重新吸取該最終樣液 ，用稀釋液做適當稀釋，選適宜稀釋度懸液，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。（3）第 3 組。吸取中和劑 于無菌小平皿中，將其置 20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，用無菌鑷子夾入 1 菌片，并使浸透于中和劑內(nèi)，作用 10min。 ml 中和劑試管中，用電動混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?0 次，混勻。吸取該最終樣液 ，用中和劑做 10 倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。（4）第 4 組。 吸取中和產(chǎn)物溶液 （以一片浸有消毒劑的載體置 中和劑內(nèi)，作用10min） 于無菌小平皿內(nèi)，將其置 20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，用無菌鑷子夾入 1 菌片，并使浸透于中和產(chǎn)物溶液中。作用 10min，用無菌鑷子取出菌片，移入含 中和產(chǎn)物溶液的試管中，用電動混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?80 次，混勻。，用中和產(chǎn)物溶液做10 倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。（5）第 5 組。吸取稀釋液 于無菌小平皿內(nèi)，將其置 20℃177。1℃ 水浴中 5min 后， 用無菌鑷子夾入 1 菌片，并使浸透于稀釋液中。作用10min，立即用無菌鑷子取出菌片移入含 稀釋液的試管中，用電動混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?80 次，混勻。，用稀釋液 做10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。（6）第 6 組。，倒入上述試驗同批次的培養(yǎng)基15ml～20ml，培養(yǎng)觀察。如出現(xiàn)細菌生長，提示試驗材料或操作過程中可能有污染。應重新進行試驗。 評價規(guī)定試驗結(jié)果符合以下全部條件，所測中和劑可判為合格:（1） 第 1 組無試驗菌，或僅有極少數(shù)試驗菌菌落生長。（2） 第 2 組有較第 1 組為多，但較第 5（組）為少的試驗菌菌落生長，并符合表 21 要求者。表 21 中和劑鑒定試驗合格標準中對第 1 組與第 2 組菌落數(shù)的要求第 1 組平板平均菌落數(shù)第 2 組平板平均菌落數(shù)05X（1～10）（X + 5）Y（10）（Y + Y）注：對抑菌作用不明顯消毒劑（如乙醇）所用中和劑的鑒定試驗中，當?shù)?1 組與第 2 組菌落數(shù)相近，難以達到本表要求時，可根據(jù)具體情況另行作出判斷和評價。（3） 第 5（組）有相似量試驗菌生長，懸液試驗在1107 cfu/ml～5107 cfu/ml之間，載體試驗在 5105 cfu/片～5106 cfu/片 之間。其組間菌落數(shù)誤差率應不超過 15%。第5 組間菌落數(shù)誤差率計算公式其計算公式如下。（4）第6組無菌生長。否則，說明試劑有污染，應更換無污染的試劑重新進行試驗。（5）連續(xù) 3 次試驗取得合格評價。 注意事項（1）試驗所分各組均有其特定意義，不得任意刪減。（2）嚴守無菌操作，保持試液和器材的無菌，注意更換吸管，以防止沾染影響試驗的準確性。（3）在計算微生物濃度時，須考慮其稀釋倍數(shù)。（4）試驗組序應按本規(guī)范所列排列。 物理法去除殘留消毒劑試驗 目 的 通過本鑒定試驗，確定常用的物理去除法是否可去除消毒體系中殘留的消毒劑，使消毒劑鑒定試驗顯示出真正的殺菌效果。 試驗器材（1）過濾沖洗法需用經(jīng)過滅菌處理的濾器、微孔濾膜、真空泵（或抽濾泵）。（2）離心沉淀法需用離心機與離心管。（3）吸附柱、分子篩柱（主要供病毒滅活試驗用）。（4）無菌稀釋液、沖洗液。要求不應影響除藥材料（如濾膜、吸附柱等）的性質(zhì)，對微生物無傷害作用。常用的有：水、緩沖液（如PBS）、稀釋液、%～%吐溫80的PBS、中和劑（可中和部分消毒成分）。（5）其他器材隨所用試驗微生物而定。 試驗設計原則（1）通過所設各組試驗結(jié)果綜合分析，應可確定所選方法是否對測試消毒劑有良好的去除作用，對試驗用微生物以及其恢復期培養(yǎng)是否有害或不良影響。（2）試驗中所用消毒劑的濃度應以殺菌試驗中使用的最高濃度為準。濃度過低不足以顯示能否將高濃度消毒劑全部去除。（3）鑒定試驗中，消毒后去除殘留消毒劑組無微生物生長，不能表明去除處理后細菌是否復蘇。此時可增加處理時間或次數(shù)，亦可適當縮短作用時間再試。作用時間最短不得少于30s，否則難以控制試驗的準確性。（4）同一消毒劑擬對多種微生物進行殺滅試驗時，所用物理去除消毒劑法應按微生物種類分別進行鑒定試驗，不得互相取代。對細菌繁殖體的試驗，可在大腸桿菌（8099）、銅綠假單胞菌（ATCC 15442）或金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）中任選其一進行試驗即可；對細菌芽孢，以枯草桿菌黑色變種（ATCC 9372）芽孢進行。當用其他特定微生物 （如龜分枝桿菌膿腫亞種） 進行殺滅試驗時，均應以該特定微生物再次進行去除消毒劑方法的鑒定試驗。（5）鑒定中應根據(jù)正式殺滅試驗的設計，選擇使用懸液定量試驗，還是載體定量試驗。通常，懸液鑒定試驗結(jié)果可用于載體試驗。 物理去除方法的鑒定（1）分組方法如下：1）消毒劑 + 菌懸液 → 培養(yǎng)觀察消毒劑對試驗菌有無殺滅或抑制作用。2）（菌懸液 + 消毒劑） + 過濾沖洗法處理 → 培養(yǎng)觀察所用去除消毒劑處理后，受到消毒劑作用后的試驗菌是否能恢復生長。3）（菌懸液 + 水） ＋過濾沖洗法處理 → 培養(yǎng)觀察去除消毒劑處理是否影響試驗菌的生長數(shù)量。4）菌懸液 → 培養(yǎng) 作為菌懸液陽性對照值。（2）操作程序如下：1） 第 1 組。，混勻后，置20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，（應先置 20℃177。1℃中水?。┯谠嚬軆?nèi)，混勻，作用至試驗預定時間。， 稀釋液試管中，混勻。吸取最終樣液 接種于平皿內(nèi)，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。2） 第 2 組。，混勻后，置20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，混勻。作用至試驗預定時間，對其進行去除消毒劑處理，并取最終樣液 接種于平皿內(nèi)，做活菌培養(yǎng)計數(shù)（如為濾膜法，可直接將濾膜有菌面朝上貼于平板表面）。如平皿生長菌落數(shù)均超過300 個，應再吸取該最終樣液 ，用 PBS 做適當稀釋，選擇適宜稀釋度懸液，吸取 ，分別接種于平皿內(nèi)，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。3） 第 3 組。，混勻后，置20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，混勻。不加消毒劑，做同上處理。取最終樣液 ml 用稀釋液做 10 倍系列稀釋，選擇 2個～3個適宜稀釋度懸液，各取 ，分別接種于平皿內(nèi)，做活菌培養(yǎng)計數(shù)（如為濾膜法，可先進行10 倍系列稀釋，再經(jīng)過濾沖洗法處理，然后直接將濾膜有菌面朝上貼于平板表面）。4） 第 4 組。吸取試驗菌懸液 ，置含 ml 稀釋液的試管中，不加消毒劑，亦不作任何去除處理，進行活菌培養(yǎng)計數(shù)，作為陽性對照值。（3） 評價規(guī)定試驗結(jié)果符合以下全部條件，所測中和劑可判為合格:1） 第 1 組無試驗菌，或僅有極少數(shù)生長。2） 第 2 組有遠較第 1 組為多，但較第 4（組）為少的試驗菌生長。在第 1 組無菌生長時，第 2 組平均每個平板 （或濾膜） 上生長菌落不少于 5 個。3） 第 4 （組）測定的結(jié)果，微生物數(shù)量應在 11