【正文】 不再持續(xù)抑制或殺滅微生物的方法。操作要點(diǎn)：①對(duì)接觸消毒劑的微生物樣本，在達(dá)到規(guī)定作用時(shí)間，即刻取樣移入鑒定合格的中和劑溶液中；②所用中和劑的濃度與容量應(yīng)與鑒定試驗(yàn)結(jié)果規(guī)定的相同；③即刻混勻，并按規(guī)定時(shí)間吸取樣液進(jìn)行隨后的培養(yǎng)檢測(cè)；④在將樣本接種培養(yǎng)基以前的操作，應(yīng)按規(guī)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行，以免微生物與中和劑或中和產(chǎn)物接觸過(guò)久。操作要點(diǎn)：①準(zhǔn)備好裝有相應(yīng)孔徑微孔濾膜的濾器；②濾膜及濾器需先經(jīng)滅菌處理；③初次過(guò)濾后，應(yīng)使用一定量對(duì)微生物無(wú)害的稀釋液進(jìn)行沖洗，沖洗次數(shù)一般以洗凈消毒劑為準(zhǔn)；④最后一次沖洗、濾凈后，將微孔濾膜以無(wú)菌操作法取出，進(jìn)行隨后的培養(yǎng)檢測(cè)。單獨(dú)使用時(shí)，一般多用于濃度系數(shù)較高的消毒劑（如醇類(lèi)消毒劑）。（2）每次吸液，均須更換一支無(wú)菌吸管，以防交叉污染。故每進(jìn)行一種消毒試驗(yàn)（包括消毒劑或微生物的更換），均需按規(guī)定對(duì)所選方法進(jìn)行鑒定試驗(yàn)，合格者方可用于正式試驗(yàn)。（2）刻度吸管（、）。（6）胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）：見(jiàn)附錄A。濃度過(guò)低，則不足以顯示能否將高濃度消毒劑全部中和。若縮短作用時(shí)間后仍無(wú)菌生長(zhǎng)，在排除其他原因的基礎(chǔ)上，可適當(dāng)下調(diào)殺菌試驗(yàn)中消毒劑濃度，再次進(jìn)行中和劑鑒定試驗(yàn)。（6）鑒定時(shí)根據(jù)所用殺菌試驗(yàn)方法，使用相應(yīng)的懸液或載體定量試驗(yàn)。（3）試驗(yàn)同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組。 試驗(yàn)分組第1組 消毒劑 + 菌懸液 →培養(yǎng)觀察消毒劑對(duì)試驗(yàn)菌有無(wú)殺滅或抑制能力。第5組 稀釋液 + 菌懸液 → 培養(yǎng)作為菌數(shù)對(duì)照。1℃水浴中待用。（1）第 1 組。接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。作用至預(yù)定時(shí)間，吸此樣液 加于含 中和劑溶液管中，混勻，作用10min。置 20℃177。（4）第 4 組。（5）第5組。（6）第 6 組。 中和劑載體定量鑒定試驗(yàn)操作程序根據(jù)試驗(yàn)分組，準(zhǔn)備足量試管和平皿，依次進(jìn)行編號(hào)。1℃水浴中5min后，用無(wú)菌鑷子夾入一菌片，并使浸透于消毒液中。吸取消毒劑 于無(wú)菌小平皿內(nèi)，將其置 20℃177。（3）第 3 組。吸取該最終樣液 ，用中和劑做 10 倍系列稀釋?zhuān)x適宜稀釋度懸液，吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。作用 10min，用無(wú)菌鑷子取出菌片，移入含 中和產(chǎn)物溶液的試管中，用電動(dòng)混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?80 次，混勻。1℃ 水浴中 5min 后， 用無(wú)菌鑷子夾入 1 菌片，并使浸透于稀釋液中。倒入上述試驗(yàn)同批次的培養(yǎng)基15ml～20ml，培養(yǎng)觀察。（2） 第 2 組有較第 1 組為多，但較第 5（組）為少的試驗(yàn)菌菌落生長(zhǎng)，并符合表 21 要求者。第5 組間菌落數(shù)誤差率計(jì)算公式其計(jì)算公式如下。 注意事項(xiàng)（1）試驗(yàn)所分各組均有其特定意義，不得任意刪減。 物理法去除殘留消毒劑試驗(yàn) 目 的 通過(guò)本鑒定試驗(yàn)，確定常用的物理去除法是否可去除消毒體系中殘留的消毒劑，使消毒劑鑒定試驗(yàn)顯示出真正的殺菌效果。（4）無(wú)菌稀釋液、沖洗液。 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則（1）通過(guò)所設(shè)各組試驗(yàn)結(jié)果綜合分析，應(yīng)可確定所選方法是否對(duì)測(cè)試消毒劑有良好的去除作用，對(duì)試驗(yàn)用微生物以及其恢復(fù)期培養(yǎng)是否有害或不良影響。此時(shí)可增加處理時(shí)間或次數(shù)，亦可適當(dāng)縮短作用時(shí)間再試。當(dāng)用其他特定微生物 （如龜分枝桿菌膿腫亞種） 進(jìn)行殺滅試驗(yàn)時(shí)，均應(yīng)以該特定微生物再次進(jìn)行去除消毒劑方法的鑒定試驗(yàn)。2）（菌懸液 + 消毒劑） + 過(guò)濾沖洗法處理 → 培養(yǎng)觀察所用去除消毒劑處理后，受到消毒劑作用后的試驗(yàn)菌是否能恢復(fù)生長(zhǎng)。混勻后，置20℃177。吸取最終樣液 接種于平皿內(nèi)，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。作用至試驗(yàn)預(yù)定時(shí)間，對(duì)其進(jìn)行去除消毒劑處理，并取最終樣液 接種于平皿內(nèi)，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)（如為濾膜法，可直接將濾膜有菌面朝上貼于平板表面）。1℃ 水浴中 5min 后，混勻。吸取試驗(yàn)菌懸液 ，置含 ml 稀釋液的試管中，不加消毒劑，亦不作任何去除處理，進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)，作為陽(yáng)性對(duì)照值。3） 第 4 （組）測(cè)定的結(jié)果，微生物數(shù)量應(yīng)在 11。2） 第 2 組有遠(yuǎn)較第 1 組為多，但較第 4（組）為少的試驗(yàn)菌生長(zhǎng)。取最終樣液 ml 用稀釋液做 10 倍系列稀釋?zhuān)x擇 2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度懸液，各取 ，分別接種于平皿內(nèi)，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)（如為濾膜法，可先進(jìn)行10 倍系列稀釋?zhuān)俳?jīng)過(guò)濾沖洗法處理，然后直接將濾膜有菌面朝上貼于平板表面）。3） 第 3 組?；靹蚝?，置20℃177。1℃中水?。┯谠嚬軆?nèi)，混勻，作用至試驗(yàn)預(yù)定時(shí)間。4）菌懸液 → 培養(yǎng) 作為菌懸液陽(yáng)性對(duì)照值。通常，懸液鑒定試驗(yàn)結(jié)果可用于載體試驗(yàn)。（4）同一消毒劑擬對(duì)多種微生物進(jìn)行殺滅試驗(yàn)時(shí)，所用物理去除消毒劑法應(yīng)按微生物種類(lèi)分別進(jìn)行鑒定試驗(yàn)，不得互相取代。濃度過(guò)低不足以顯示能否將高濃度消毒劑全部去除。常用的有：水、緩沖液（如PBS）、稀釋液、%～%吐溫80的PBS、中和劑（可中和部分消毒成分）。（2）離心沉淀法需用離心機(jī)與離心管。（3）在計(jì)算微生物濃度時(shí)，須考慮其稀釋倍數(shù)。否則，說(shuō)明試劑有污染，應(yīng)更換無(wú)污染的試劑重新進(jìn)行試驗(yàn)。（3） 第 5（組）有相似量試驗(yàn)菌生長(zhǎng)，懸液試驗(yàn)在1107 cfu/ml～5107 cfu/ml之間，載體試驗(yàn)在 5105 cfu/片～5106 cfu/片 之間。應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)。用稀釋液 做10倍系列稀釋?zhuān)x適宜稀釋度懸液，吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（5）第 5 組。 吸取中和產(chǎn)物溶液 （以一片浸有消毒劑的載體置 中和劑內(nèi)，作用10min） 于無(wú)菌小平皿內(nèi)，將其置 20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，用無(wú)菌鑷子夾入 1 菌片，并使浸透于中和劑內(nèi)，作用 10min。作用10min，分別接種于各平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。用電動(dòng)混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?0次，吸取該最終樣液 ，接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（1）第1組。如出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)，可能提示試驗(yàn)材料或操作過(guò)程中有污染。1℃ 水浴中5min 后，混勻。1℃ 水浴中 5min 后，（，作用 10min 配制而成）于試管內(nèi)，混勻。作用10min。如平板生長(zhǎng)菌落數(shù)均超過(guò) 300 個(gè)，應(yīng)以稀釋液對(duì)上述最終樣液作適宜稀釋后，再次進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。置 20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，混勻。制成含有機(jī)干擾物質(zhì)的菌懸液，置20℃177。 中和劑懸液定量鑒定試驗(yàn)操作程序 根據(jù)試驗(yàn)分組，準(zhǔn)備足量試管和平皿，依次進(jìn)行編號(hào)。第3組 中和劑 + 菌懸液 → 培養(yǎng)觀察中和劑是否抑菌。當(dāng)3組平板上長(zhǎng)出的菌落數(shù)接近，如果以陽(yáng)性對(duì)照組為標(biāo)準(zhǔn)（X），前兩組長(zhǎng)菌數(shù)為（X177。初選操作程序如下：（1） 試驗(yàn)菌懸液（含菌量為 1103 cfu/ml～3103 cfu/ml）加入含 中和劑試管中，混勻，作用30min后，用TSA傾注法培養(yǎng)。對(duì)細(xì)菌繁殖體，在大腸桿菌（8099）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、銅綠假單胞菌（ATCC 15442）中任選其一進(jìn)行試驗(yàn)即可；對(duì)細(xì)菌芽孢，以枯草桿菌黑色變種（ATCC 9372）芽孢進(jìn)行。細(xì)菌是否復(fù)蘇。（2）在確定用何種中和劑進(jìn)行鑒定試驗(yàn)有困難時(shí)，可對(duì)多個(gè)中和劑進(jìn)行初選以確定（見(jiàn)本款文后【附】）。（4）恒溫水浴箱。 中和劑鑒定試驗(yàn) 目 的確定所選中和劑是否適用于擬進(jìn)行的細(xì)菌和真菌殺滅試驗(yàn)。（3）為保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，所用吸管的容量應(yīng)盡量與擬吸取的液體量相近，不要用大吸管吸取少量液體；試驗(yàn)樣本的混勻操作，必須認(rèn)真進(jìn)行；盡量減少中和劑或中和產(chǎn)物與試驗(yàn)微生物的接觸時(shí)間。操作要點(diǎn)：①對(duì)接觸消毒劑的微生物樣本，在達(dá)到規(guī)定作用時(shí)間后，即時(shí)以對(duì)微生物無(wú)害的稀釋液稀釋?zhuān)♂尡壤S試驗(yàn)需要決定；②電動(dòng)混合或敲打振蕩，使之混勻；③吸取稀釋樣液進(jìn)行隨后培養(yǎng)檢測(cè)。但若稀釋過(guò)多，微生物濃度下降，可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。多用于難以找到適宜中和劑的消毒劑試驗(yàn)中，如以植物提取物制備的消毒劑。對(duì)常用消毒劑，雖有一些中和劑介紹，但在實(shí)際應(yīng)用中由于情況多變，效果不一定都理想。（3）不破壞培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成份，不影響其透明度。因?yàn)橄倔w系中殘留的消毒劑，可能對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖具有一定抑制作用，從而可導(dǎo)致對(duì)殺菌效果偏高的錯(cuò)誤判斷，甚至產(chǎn)生假陰性結(jié)果。勿使培養(yǎng)基外溢，以免影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和造成環(huán)境的污染。（5）每吸取一個(gè)稀釋度樣液，必須更換一支吸管，以減少誤差。（1）平板間誤差率計(jì)算公式：（2）稀釋度間誤差率計(jì)算公式： 注意事項(xiàng)（1）嚴(yán)格無(wú)菌操作，防止污染。將求得的平均菌落值，再乘以稀釋倍數(shù)，即得每毫升原樣液中的菌量。（10）計(jì)數(shù)菌落時(shí)，一般以肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，使底向上，置37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)。一般需接種2個(gè)～3個(gè)不同稀釋度。如此類(lèi)推，直至最后一管。（2）將試管按需要數(shù)量分組排列于試管架上， 每管加入 稀釋液。洗菌時(shí)，一般以稀釋液為洗液。（4）電動(dòng)混合器 操作程序本規(guī)范要求在殺菌試驗(yàn)中的活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)統(tǒng)一使用傾注法。 活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)技術(shù) 適用范圍測(cè)定細(xì)菌懸液、菌片、采樣液等樣本中含有活菌的數(shù)量。此時(shí)，應(yīng)提高初始菌濃度，以便達(dá)到所需的菌量。 注意事項(xiàng)（1）用濁度計(jì)測(cè)定的菌懸液濃度，只用于在滴染菌片時(shí)對(duì)菌懸液稀釋度的估計(jì)。菌液滴加量每片為10μl。染菌用菌懸液：使用TSB營(yíng)養(yǎng)肉湯配制。在剪開(kāi)前，先將脫脂的布?jí)K按載體規(guī)定的大小，抽去邊緣一周的經(jīng)緯紗各一根，再按抽紗痕剪開(kāi)。 當(dāng)以金屬片為載體時(shí)，因方形金屬載體在振敲時(shí)可將玻璃試管撞碎，故改用 12mm 直徑圓形金屬片（厚 ）。 菌片的制備程序（1）消毒試驗(yàn)中使用的菌片是以菌液滴加于載體上制成。待冷至室溫后，保存于4℃冰箱中備用。棄上清液，加蒸餾水吹吸使芽孢重新懸浮。將第一和第二批洗下的菌懸液集中于一含玻璃珠的無(wú)菌三角燒瓶中，振搖5min，打碎菌塊，使成均勻的芽孢懸液。水洗，待干后鏡檢。②將涂片放入平皿內(nèi)，片上放兩層濾紙，滴加足量的 % 孔雀綠水溶液。當(dāng)芽孢形成率達(dá) 95% 以上時(shí)，即可進(jìn)行以下處理。用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)的菌懸液，劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，于37℃培養(yǎng) 18h～24h。應(yīng)當(dāng)天使用不得過(guò)夜。2）取菌種第3代～14代的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物（18h～24h）， ml～，反復(fù)吹吸，洗下菌苔。 細(xì)菌懸液制備程序（1）細(xì)菌繁殖體懸液的制備1）取凍干菌種管，在無(wú)菌操作下打開(kāi)，以毛細(xì)吸管加入適量營(yíng)養(yǎng)肉湯，輕柔吹吸數(shù)次，使菌種融化分散。（11）刻度吸管（、），毛細(xì)吸管。（7）革蘭染色液：見(jiàn)附錄A。（3）磷酸鹽緩沖液：見(jiàn)附錄A。 菌懸液與菌片的制備 適用范圍制備消毒劑殺菌試驗(yàn)用細(xì)菌懸液與菌片，以供消毒劑殺菌試驗(yàn)時(shí)使用。8)填好的消毒記錄應(yīng)及時(shí)上報(bào)。凡應(yīng)消毒的物品，不得遺漏。3）消毒過(guò)程中，不得吸煙、飲食。(4)消毒人員注意事項(xiàng)1）出發(fā)前，要檢查應(yīng)攜帶的消毒工具是否齊全無(wú)故障，消毒劑是否足夠。所用消毒工具表面用消毒劑進(jìn)行擦洗消毒。13)室內(nèi)消毒后，必要時(shí)對(duì)廁所、垃圾、下水道口、自來(lái)水龍頭、缸水和井水等進(jìn)行消毒。12)病人用過(guò)的餐（飲）具、污染的衣物若不能集中在消毒站消毒時(shí)，可在疫點(diǎn)進(jìn)行煮沸、浸泡或擦拭消毒。8)消毒前應(yīng)關(guān)閉門(mén)窗，將水缸蓋好，將未被污染的貴重衣物、飲食類(lèi)物品、名貴字畫(huà)及陳列物品收藏好。根據(jù)消毒對(duì)象及其污染情況，選擇適宜的消毒方法。3)對(duì)脫掉外衣應(yīng)放在自帶的布袋中（不要放在污染或可能受到污染的地方）?！傲尽笔侵福孩傧痉置诨蚺判刮铮ㄈ绾粑纻魅静≈饕獮榭诒欠置谖?，腸道傳染病主要為糞便，接觸性傳染病主要為膿液、痂皮等）；②消毒生活用具；③消毒雙手；④消毒衣服、被單；⑤消毒患者居室；⑥消毒生活污水、污物。加強(qiáng)易感人群的保護(hù)。盡量避免破壞消毒對(duì)象的使用價(jià)值和造成環(huán)境的污染。常用消毒劑有過(guò)氧乙酸、含氯消毒劑、碘伏等。 裝備要求承擔(dān)疫源地消毒任務(wù)的單位，應(yīng)根據(jù)工作需要和條件配備消毒工具和防護(hù)用品，儲(chǔ)備一定數(shù)量的消毒劑。（4）各類(lèi)傳染病(包括非法定傳染病)爆發(fā)流行時(shí)應(yīng)在當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制和監(jiān)督機(jī)構(gòu)的監(jiān)督指導(dǎo)下，由有關(guān)單位及時(shí)進(jìn)行消毒，或由當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制和監(jiān)督負(fù)責(zé)對(duì)其進(jìn)行消毒處理。(5) 處理銳利器械和用具應(yīng)采取有效防護(hù)措施，以避免可能對(duì)人體的刺、割等傷害。(1) 熱力滅菌：干熱滅菌時(shí)應(yīng)防止燃燒；壓力蒸汽滅菌應(yīng)防止發(fā)生爆炸事故及可能對(duì)操作人員造成的灼傷事故。4）選擇表面消毒方法，應(yīng)考慮表面性質(zhì)，光滑表面可選擇紫外線消毒器近距離照射，或液體消毒劑擦拭；多孔材料表面可采用噴霧消毒法。（4）根據(jù)消毒物品的性質(zhì)選擇消毒方法選擇消毒方法時(shí)需考慮，一是要保護(hù)消毒物品不受損壞，二是使消毒方法易于發(fā)揮作用。2）對(duì)受到真菌、親水病毒、螺旋體、支原體、衣原體和病原微生物污染的物品，選用中水平以上的消毒方法。但中度危險(xiǎn)性物品的消毒要求并不相同，有些要求嚴(yán)格，例如內(nèi)窺鏡、體溫表等必須達(dá)到高水平消毒，需采用高水平消毒法消毒。 選擇消毒、滅菌方法的原則（1）使用經(jīng)衛(wèi)生行政部門(mén)批準(zhǔn)的消毒藥、械，并按照批準(zhǔn)使用的范圍和方法在醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)和疫源地等消毒中使用。（4）親水病毒（沒(méi)有脂質(zhì)包膜的病毒），例如甲型肝炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等。例如，毛巾、面盆、痰盂（杯）、地面、便器、餐具、茶具、墻面、桌面、床面、被褥、一般診斷用品(聽(tīng)診器、聽(tīng)筒、血壓計(jì)袖帶等)等。（2）中度危險(xiǎn)性物品：這類(lèi)物品僅和破損皮膚、黏膜相接觸，而不進(jìn)入無(wú)菌的組織內(nèi)。（4）低水平消毒法：只能殺滅細(xì)菌繁殖體（分枝桿菌除外）和親脂病毒的化學(xué)消毒劑和通風(fēng)換氣、沖洗等機(jī)械除菌法。（2）高水平消毒法：可以殺滅各種微生物，對(duì)細(xì)菌芽孢殺滅達(dá)到消毒效果的方法。3）在皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)時(shí)，采用的誘導(dǎo)濃度應(yīng)為引起皮膚刺激反應(yīng)的最低濃度或原液，激發(fā)濃度應(yīng)為不引起皮膚刺激反應(yīng)的最高濃度或原液。消毒劑原形是指在銷(xiāo)售過(guò)程中原包裝的粉劑、片劑或原液。 毒理學(xué)試驗(yàn)用消毒產(chǎn)品樣品的規(guī)定（1）受試樣品必須是按照既定的生產(chǎn)工藝和配方進(jìn)行規(guī)范化生產(chǎn)的消毒產(chǎn)品，其成分和濃度與實(shí)際生產(chǎn)和銷(xiāo)售的相同。使用過(guò)程中，必需接觸皮膚的其它消毒劑，也應(yīng)增做完整皮膚刺激試驗(yàn)。視其試驗(yàn)結(jié)果，判定是否需做其它試驗(yàn)項(xiàng)目。(3)第三類(lèi)消毒劑：指與國(guó)內(nèi)已