【正文】 不再持續(xù)抑制或殺滅微生物的方法。操作要點：①對接觸消毒劑的微生物樣本，在達到規(guī)定作用時間，即刻取樣移入鑒定合格的中和劑溶液中；②所用中和劑的濃度與容量應與鑒定試驗結果規(guī)定的相同；③即刻混勻，并按規(guī)定時間吸取樣液進行隨后的培養(yǎng)檢測；④在將樣本接種培養(yǎng)基以前的操作，應按規(guī)定時間內(nèi)進行，以免微生物與中和劑或中和產(chǎn)物接觸過久。操作要點：①準備好裝有相應孔徑微孔濾膜的濾器；②濾膜及濾器需先經(jīng)滅菌處理；③初次過濾后，應使用一定量對微生物無害的稀釋液進行沖洗，沖洗次數(shù)一般以洗凈消毒劑為準；④最后一次沖洗、濾凈后，將微孔濾膜以無菌操作法取出，進行隨后的培養(yǎng)檢測。單獨使用時，一般多用于濃度系數(shù)較高的消毒劑（如醇類消毒劑）。（2）每次吸液，均須更換一支無菌吸管，以防交叉污染。故每進行一種消毒試驗（包括消毒劑或微生物的更換），均需按規(guī)定對所選方法進行鑒定試驗，合格者方可用于正式試驗。（2）刻度吸管（、）。（6）胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）：見附錄A。濃度過低，則不足以顯示能否將高濃度消毒劑全部中和。若縮短作用時間后仍無菌生長，在排除其他原因的基礎上，可適當下調(diào)殺菌試驗中消毒劑濃度，再次進行中和劑鑒定試驗。（6）鑒定時根據(jù)所用殺菌試驗方法，使用相應的懸液或載體定量試驗。（3）試驗同時設陽性對照組。 試驗分組第1組 消毒劑 + 菌懸液 →培養(yǎng)觀察消毒劑對試驗菌有無殺滅或抑制能力。第5組 稀釋液 + 菌懸液 → 培養(yǎng)作為菌數(shù)對照。1℃水浴中待用。（1）第 1 組。接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。作用至預定時間，吸此樣液 加于含 中和劑溶液管中，混勻，作用10min。置 20℃177。（4）第 4 組。（5）第5組。（6）第 6 組。 中和劑載體定量鑒定試驗操作程序根據(jù)試驗分組，準備足量試管和平皿，依次進行編號。1℃水浴中5min后，用無菌鑷子夾入一菌片，并使浸透于消毒液中。吸取消毒劑 于無菌小平皿內(nèi)，將其置 20℃177。（3）第 3 組。吸取該最終樣液 ，用中和劑做 10 倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。作用 10min，用無菌鑷子取出菌片，移入含 中和產(chǎn)物溶液的試管中，用電動混合器混合20s，或將試管振打 80 次，混勻。1℃ 水浴中 5min 后， 用無菌鑷子夾入 1 菌片，并使浸透于稀釋液中。倒入上述試驗同批次的培養(yǎng)基15ml～20ml，培養(yǎng)觀察。（2） 第 2 組有較第 1 組為多，但較第 5（組）為少的試驗菌菌落生長，并符合表 21 要求者。第5 組間菌落數(shù)誤差率計算公式其計算公式如下。 注意事項（1）試驗所分各組均有其特定意義，不得任意刪減。 物理法去除殘留消毒劑試驗 目 的 通過本鑒定試驗，確定常用的物理去除法是否可去除消毒體系中殘留的消毒劑，使消毒劑鑒定試驗顯示出真正的殺菌效果。（4）無菌稀釋液、沖洗液。 試驗設計原則（1）通過所設各組試驗結果綜合分析，應可確定所選方法是否對測試消毒劑有良好的去除作用，對試驗用微生物以及其恢復期培養(yǎng)是否有害或不良影響。此時可增加處理時間或次數(shù)，亦可適當縮短作用時間再試。當用其他特定微生物 （如龜分枝桿菌膿腫亞種） 進行殺滅試驗時，均應以該特定微生物再次進行去除消毒劑方法的鑒定試驗。2）（菌懸液 + 消毒劑） + 過濾沖洗法處理 → 培養(yǎng)觀察所用去除消毒劑處理后，受到消毒劑作用后的試驗菌是否能恢復生長?；靹蚝?，置20℃177。吸取最終樣液 接種于平皿內(nèi)，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。作用至試驗預定時間，對其進行去除消毒劑處理，并取最終樣液 接種于平皿內(nèi)，做活菌培養(yǎng)計數(shù)（如為濾膜法，可直接將濾膜有菌面朝上貼于平板表面）。1℃ 水浴中 5min 后，混勻。吸取試驗菌懸液 ，置含 ml 稀釋液的試管中，不加消毒劑，亦不作任何去除處理，進行活菌培養(yǎng)計數(shù)，作為陽性對照值。3） 第 4 （組）測定的結果，微生物數(shù)量應在 11。2） 第 2 組有遠較第 1 組為多，但較第 4（組）為少的試驗菌生長。取最終樣液 ml 用稀釋液做 10 倍系列稀釋，選擇 2個～3個適宜稀釋度懸液，各取 ，分別接種于平皿內(nèi)，做活菌培養(yǎng)計數(shù)（如為濾膜法，可先進行10 倍系列稀釋，再經(jīng)過濾沖洗法處理，然后直接將濾膜有菌面朝上貼于平板表面）。3） 第 3 組?；靹蚝螅?0℃177。1℃中水浴）于試管內(nèi)，混勻，作用至試驗預定時間。4）菌懸液 → 培養(yǎng) 作為菌懸液陽性對照值。通常，懸液鑒定試驗結果可用于載體試驗。（4）同一消毒劑擬對多種微生物進行殺滅試驗時，所用物理去除消毒劑法應按微生物種類分別進行鑒定試驗，不得互相取代。濃度過低不足以顯示能否將高濃度消毒劑全部去除。常用的有：水、緩沖液（如PBS）、稀釋液、%～%吐溫80的PBS、中和劑（可中和部分消毒成分）。（2）離心沉淀法需用離心機與離心管。（3）在計算微生物濃度時，須考慮其稀釋倍數(shù)。否則，說明試劑有污染，應更換無污染的試劑重新進行試驗。（3） 第 5（組）有相似量試驗菌生長，懸液試驗在1107 cfu/ml～5107 cfu/ml之間，載體試驗在 5105 cfu/片～5106 cfu/片 之間。應重新進行試驗。用稀釋液 做10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。（5）第 5 組。 吸取中和產(chǎn)物溶液 （以一片浸有消毒劑的載體置 中和劑內(nèi)，作用10min） 于無菌小平皿內(nèi)，將其置 20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，用無菌鑷子夾入 1 菌片，并使浸透于中和劑內(nèi)，作用 10min。作用10min，分別接種于各平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。用電動混合器混合20s，或將試管振打80次，吸取該最終樣液 ，接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計數(shù)。（1）第1組。如出現(xiàn)細菌生長，可能提示試驗材料或操作過程中有污染。1℃ 水浴中5min 后，混勻。1℃ 水浴中 5min 后，（，作用 10min 配制而成）于試管內(nèi)，混勻。作用10min。如平板生長菌落數(shù)均超過 300 個，應以稀釋液對上述最終樣液作適宜稀釋后，再次進行活菌培養(yǎng)計數(shù)。置 20℃177。1℃ 水浴中 5min 后，混勻。制成含有機干擾物質(zhì)的菌懸液，置20℃177。 中和劑懸液定量鑒定試驗操作程序 根據(jù)試驗分組，準備足量試管和平皿，依次進行編號。第3組 中和劑 + 菌懸液 → 培養(yǎng)觀察中和劑是否抑菌。當3組平板上長出的菌落數(shù)接近，如果以陽性對照組為標準（X），前兩組長菌數(shù)為（X177。初選操作程序如下：（1） 試驗菌懸液（含菌量為 1103 cfu/ml～3103 cfu/ml）加入含 中和劑試管中，混勻，作用30min后，用TSA傾注法培養(yǎng)。對細菌繁殖體，在大腸桿菌（8099）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、銅綠假單胞菌（ATCC 15442）中任選其一進行試驗即可；對細菌芽孢，以枯草桿菌黑色變種（ATCC 9372）芽孢進行。細菌是否復蘇。（2）在確定用何種中和劑進行鑒定試驗有困難時，可對多個中和劑進行初選以確定（見本款文后【附】）。（4）恒溫水浴箱。 中和劑鑒定試驗 目 的確定所選中和劑是否適用于擬進行的細菌和真菌殺滅試驗。（3）為保證試驗的準確性，所用吸管的容量應盡量與擬吸取的液體量相近，不要用大吸管吸取少量液體；試驗樣本的混勻操作，必須認真進行；盡量減少中和劑或中和產(chǎn)物與試驗微生物的接觸時間。操作要點：①對接觸消毒劑的微生物樣本，在達到規(guī)定作用時間后，即時以對微生物無害的稀釋液稀釋，稀釋比例隨試驗需要決定；②電動混合或敲打振蕩，使之混勻；③吸取稀釋樣液進行隨后培養(yǎng)檢測。但若稀釋過多，微生物濃度下降，可出現(xiàn)假陰性結果。多用于難以找到適宜中和劑的消毒劑試驗中，如以植物提取物制備的消毒劑。對常用消毒劑，雖有一些中和劑介紹，但在實際應用中由于情況多變，效果不一定都理想。（3）不破壞培養(yǎng)基的營養(yǎng)成份，不影響其透明度。因為消毒體系中殘留的消毒劑，可能對微生物的生長繁殖具有一定抑制作用，從而可導致對殺菌效果偏高的錯誤判斷，甚至產(chǎn)生假陰性結果。勿使培養(yǎng)基外溢，以免影響結果的準確性和造成環(huán)境的污染。（5）每吸取一個稀釋度樣液，必須更換一支吸管，以減少誤差。（1）平板間誤差率計算公式：（2）稀釋度間誤差率計算公式： 注意事項（1）嚴格無菌操作，防止污染。將求得的平均菌落值，再乘以稀釋倍數(shù)，即得每毫升原樣液中的菌量。（10）計數(shù)菌落時，一般以肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查。待瓊脂凝固后，翻轉平皿，使底向上，置37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)。一般需接種2個～3個不同稀釋度。如此類推，直至最后一管。（2）將試管按需要數(shù)量分組排列于試管架上， 每管加入 稀釋液。洗菌時，一般以稀釋液為洗液。（4）電動混合器 操作程序本規(guī)范要求在殺菌試驗中的活菌培養(yǎng)計數(shù)統(tǒng)一使用傾注法。 活菌培養(yǎng)計數(shù)技術 適用范圍測定細菌懸液、菌片、采樣液等樣本中含有活菌的數(shù)量。此時，應提高初始菌濃度，以便達到所需的菌量。 注意事項（1）用濁度計測定的菌懸液濃度，只用于在滴染菌片時對菌懸液稀釋度的估計。菌液滴加量每片為10μl。染菌用菌懸液：使用TSB營養(yǎng)肉湯配制。在剪開前，先將脫脂的布塊按載體規(guī)定的大小，抽去邊緣一周的經(jīng)緯紗各一根，再按抽紗痕剪開。 當以金屬片為載體時，因方形金屬載體在振敲時可將玻璃試管撞碎，故改用 12mm 直徑圓形金屬片（厚 ）。 菌片的制備程序（1）消毒試驗中使用的菌片是以菌液滴加于載體上制成。待冷至室溫后，保存于4℃冰箱中備用。棄上清液，加蒸餾水吹吸使芽孢重新懸浮。將第一和第二批洗下的菌懸液集中于一含玻璃珠的無菌三角燒瓶中，振搖5min，打碎菌塊，使成均勻的芽孢懸液。水洗，待干后鏡檢。②將涂片放入平皿內(nèi)，片上放兩層濾紙，滴加足量的 % 孔雀綠水溶液。當芽孢形成率達 95% 以上時，即可進行以下處理。用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)的菌懸液，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，于37℃培養(yǎng) 18h～24h。應當天使用不得過夜。2）取菌種第3代～14代的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物（18h～24h）， ml～，反復吹吸，洗下菌苔。 細菌懸液制備程序（1）細菌繁殖體懸液的制備1）取凍干菌種管，在無菌操作下打開，以毛細吸管加入適量營養(yǎng)肉湯，輕柔吹吸數(shù)次，使菌種融化分散。（11）刻度吸管（、），毛細吸管。（7）革蘭染色液：見附錄A。（3）磷酸鹽緩沖液：見附錄A。 菌懸液與菌片的制備 適用范圍制備消毒劑殺菌試驗用細菌懸液與菌片，以供消毒劑殺菌試驗時使用。8)填好的消毒記錄應及時上報。凡應消毒的物品，不得遺漏。3）消毒過程中，不得吸煙、飲食。(4)消毒人員注意事項1）出發(fā)前，要檢查應攜帶的消毒工具是否齊全無故障，消毒劑是否足夠。所用消毒工具表面用消毒劑進行擦洗消毒。13)室內(nèi)消毒后，必要時對廁所、垃圾、下水道口、自來水龍頭、缸水和井水等進行消毒。12)病人用過的餐（飲）具、污染的衣物若不能集中在消毒站消毒時，可在疫點進行煮沸、浸泡或擦拭消毒。8)消毒前應關閉門窗，將水缸蓋好，將未被污染的貴重衣物、飲食類物品、名貴字畫及陳列物品收藏好。根據(jù)消毒對象及其污染情況，選擇適宜的消毒方法。3)對脫掉外衣應放在自帶的布袋中（不要放在污染或可能受到污染的地方）?！傲尽笔侵福孩傧痉置诨蚺判刮铮ㄈ绾粑纻魅静≈饕獮榭诒欠置谖?，腸道傳染病主要為糞便，接觸性傳染病主要為膿液、痂皮等）；②消毒生活用具；③消毒雙手；④消毒衣服、被單；⑤消毒患者居室；⑥消毒生活污水、污物。加強易感人群的保護。盡量避免破壞消毒對象的使用價值和造成環(huán)境的污染。常用消毒劑有過氧乙酸、含氯消毒劑、碘伏等。 裝備要求承擔疫源地消毒任務的單位，應根據(jù)工作需要和條件配備消毒工具和防護用品，儲備一定數(shù)量的消毒劑。（4）各類傳染病(包括非法定傳染病)爆發(fā)流行時應在當?shù)丶膊☆A防控制和監(jiān)督機構的監(jiān)督指導下，由有關單位及時進行消毒，或由當?shù)丶膊☆A防控制和監(jiān)督負責對其進行消毒處理。(5) 處理銳利器械和用具應采取有效防護措施，以避免可能對人體的刺、割等傷害。(1) 熱力滅菌：干熱滅菌時應防止燃燒；壓力蒸汽滅菌應防止發(fā)生爆炸事故及可能對操作人員造成的灼傷事故。4）選擇表面消毒方法，應考慮表面性質(zhì)，光滑表面可選擇紫外線消毒器近距離照射，或液體消毒劑擦拭；多孔材料表面可采用噴霧消毒法。（4）根據(jù)消毒物品的性質(zhì)選擇消毒方法選擇消毒方法時需考慮，一是要保護消毒物品不受損壞，二是使消毒方法易于發(fā)揮作用。2）對受到真菌、親水病毒、螺旋體、支原體、衣原體和病原微生物污染的物品，選用中水平以上的消毒方法。但中度危險性物品的消毒要求并不相同，有些要求嚴格，例如內(nèi)窺鏡、體溫表等必須達到高水平消毒，需采用高水平消毒法消毒。 選擇消毒、滅菌方法的原則（1）使用經(jīng)衛(wèi)生行政部門批準的消毒藥、械，并按照批準使用的范圍和方法在醫(yī)療衛(wèi)生機構和疫源地等消毒中使用。（4）親水病毒（沒有脂質(zhì)包膜的病毒），例如甲型肝炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等。例如，毛巾、面盆、痰盂（杯）、地面、便器、餐具、茶具、墻面、桌面、床面、被褥、一般診斷用品(聽診器、聽筒、血壓計袖帶等)等。（2）中度危險性物品：這類物品僅和破損皮膚、黏膜相接觸，而不進入無菌的組織內(nèi)。（4）低水平消毒法：只能殺滅細菌繁殖體（分枝桿菌除外）和親脂病毒的化學消毒劑和通風換氣、沖洗等機械除菌法。（2）高水平消毒法：可以殺滅各種微生物，對細菌芽孢殺滅達到消毒效果的方法。3）在皮膚變態(tài)反應試驗時，采用的誘導濃度應為引起皮膚刺激反應的最低濃度或原液，激發(fā)濃度應為不引起皮膚刺激反應的最高濃度或原液。消毒劑原形是指在銷售過程中原包裝的粉劑、片劑或原液。 毒理學試驗用消毒產(chǎn)品樣品的規(guī)定（1）受試樣品必須是按照既定的生產(chǎn)工藝和配方進行規(guī)范化生產(chǎn)的消毒產(chǎn)品，其成分和濃度與實際生產(chǎn)和銷售的相同。使用過程中，必需接觸皮膚的其它消毒劑，也應增做完整皮膚刺激試驗。視其試驗結果，判定是否需做其它試驗項目。(3)第三類消毒劑：指與國內(nèi)已