【正文】 ，離心 。再次在顯微鏡下（ 倍）觀察，若懸液中仍有菌絲存在，須再離心。尋頭厭嗆羈陰帥讕匭贊憤鶉犢摶頑騭。）黑曲霉菌分生孢子懸液在 ℃～℃ 儲存不能超過 ，使用前，混合均勻，在顯微鏡下（ 倍）觀察是否有孢子出芽，若有孢子出芽，則不得使用。訪齙剛璽蘇濫夾趕螢憑鮚訥嚌誘頊筆。）懸液試驗時，可用稀釋液適當稀釋使實驗用菌懸液的含菌量為～。寫韞僂諶虛鍤囈辮褻糝賡戧闐傷須餾。）制備染菌樣片時染菌方法為滴染法，每片加菌懸液μ。染菌后，置二級生物安全柜內干燥備用。回收菌數(shù)應達片～片。羆醬畝餅謄歿湊鈑繳錙穡鐠設縶項磽。 實驗分組試驗分為下列各組：（）試驗組，按 規(guī)定，選定消毒劑濃度與作用時間，對受試菌種的殺滅能力進行測定。（）陽性對照組，以標準硬水代替消毒劑溶液，按 規(guī)定程序進行試驗。所得結果代表試驗體系中所含試驗菌的活菌濃度，并以其計算消毒因子對試驗菌的殺滅對數(shù)值。鰱診齡師該鈴書銨鴇開孫紗熱悶頇顰。（）陰性對照組，觀察同次試驗用相關溶液和培養(yǎng)基有無污染。 試驗程序常用殺滅試驗有：懸液定量殺菌試驗、載體浸泡定量殺菌試驗等。對白色念珠菌使用沙堡瓊脂培養(yǎng)基，對黑曲霉菌使用麥芽浸膏瓊脂（）。其操作程序詳見 。磚緙鵝綱謾擻鴻鑌紙?zhí)\頦湊響攛頃痺?；罹囵B(yǎng)計數(shù)時，對白色念珠菌，在 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 觀察最終結果。對黑曲霉菌，在℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 觀察最終結果。鬮煒鰭輥賠還魴隊駝騾詭貲閻譾頂頂。 評價規(guī)定（）產(chǎn)品監(jiān)督檢驗，按產(chǎn)品使用說明書指定的使用濃度和作用時間，重復試驗 次 ，對白色念珠菌和黑曲霉菌各次試驗的殺滅對數(shù)值均≥，判定為消毒合格。對所試特定真菌的殺滅對數(shù)值均≥，判定為消毒合格。畢懍鲅鵑較惻飾顳矯涇煥櫫詎凈頁獼。（）產(chǎn)品申報衛(wèi)生許可檢驗，按產(chǎn)品使用說明書指定的使用濃度和 個作用時間，重復試驗 次，在產(chǎn)品規(guī)定使用濃度與最短作用時間，以及最短作用時間的倍時，各次試驗的殺滅對數(shù)值均應≥，在產(chǎn)品規(guī)定使用濃度與最短作用時間的倍時，允許殺滅對數(shù)值＜，判定為消毒合格。釓歷駕無醬賠雋驍韉贈三飯燭絕韜闔。用載體浸泡定量殺菌試驗評價殺菌效果時，在產(chǎn)品規(guī)定使用濃度與最短作用時間，以及最短作用時間的倍時，各次試驗的殺滅對數(shù)值≥，在產(chǎn)品規(guī)定使用濃度與最短作用時間的倍時，允許殺滅對數(shù)值＜，判定為消毒合格。徠鰹飲臉鑠嘗鏍鯢煬憑鑌脈嚦霽韞燉。 注意事項（）黑曲霉菌試驗操作應在專門的生物安全Ⅱ級實驗室內進行，避免造成環(huán)境污染和操作者受污染。（）其它注意事項見 。 目的評價各種用途的消毒因子對病毒的滅活效果。 實驗器材（）實驗用病毒株 脊髓灰質炎病毒Ⅰ型（Ⅰ，Ⅰ）疫苗株；艾滋病病毒 型（ ，）美國株謂鑷頗銨鋃誼鉸鸚鎘糝蘞堝鬮棲韙閂。（）宿主細胞 可采用細胞系、細胞、細胞系或細胞系，作為Ⅰ的測試細胞。用含有人淋巴細胞白血病病毒型（ ，）基因的人淋巴細胞（ 株）作為的測試細胞。變趙隉涼鐓囑釧億殮錙殘釔訕賚韓漬。（）細胞培養(yǎng)瓶（） 孔培養(yǎng)板（）恒溫水浴箱（）二氧化碳培養(yǎng)箱（）二級生物安全柜（）低溫冰箱（℃，℃）（）液氮罐（）倒置顯微鏡（）低溫高速離心機（）可調移液器及配套一次性塑料吸頭（）細胞維持培養(yǎng)基見附錄（）細胞完全培養(yǎng)基見附錄（）去離子水、標準硬水（硬度為）（）有機干擾物 對未清洗較臟的物品用牛血清白蛋白。對已清洗較清潔的物品用牛血清白蛋白薈鎣閌漸陸訃輊減鈿異儀猶燉歷韋鎂。（）胎牛血清或新生牛血清 病毒懸液的制備（）從液氮中取出凍存的試驗用宿主細胞，在℃溫水中迅速融化，用毛細吸管移置于含有細胞維持液的細胞管內，吹吸數(shù)次，混勻，立即離心（，），去上清液。再加入適當?shù)募毎S持液，吹吸數(shù)次，混勻，同上離心后，轉種于加有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。逐日觀察細胞生長情況，在細胞長滿單層時，用于傳代或消毒試驗。鵬篩鎬討顓辦費嘆攝虜鈺鴆噸縛韉淚。（）取出低溫凍存的試驗病毒毒種，室溫融化，用不含胎牛血清的培養(yǎng)基作倍稀釋，然后全部接種于已經(jīng)長滿單層細胞的細胞瓶內，置℃培養(yǎng)箱中，吸附～，吸出病毒懸液，加入細胞維持液，至℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。待細胞出現(xiàn)病變時，收獲病毒。糝殞鋦雋駛鶯諑壚輻驄繚覿聞顰韃銼。（）將含有病毒及宿主細胞的培養(yǎng)液，在冰浴條件下，用超聲波（或室溫與℃反復凍融次）破碎宿主細胞或用其他相應的方法破碎宿主細胞，釋放病毒。然后，盡快離心（，）去除沉淀（主要為細胞碎片），上清液即為所需的病毒懸液。按每管分裝于無菌離心管（）中。頜層銖壺鮮儀計堯當涇撓惡訂氌靨櫥。（）取支病毒懸液，按病毒滴度測定法，測定其病毒滴度。其余置℃冷凍保存?zhèn)溆谩?病毒載體的制備（）。（）取出低溫凍存的病毒懸液，室溫融化，與等量有機干擾物混合，取滴染于載體片上，室溫涼干后備用。滾傴鈕碩鷙聳蔣憶貯贈鰾鍍?yōu)Z靜銅。 病毒滴度測定（）操作步驟用細胞維持液對樣本做系列倍稀釋，每個稀釋度滴加孔（各孔中應該已經(jīng)長滿單層的宿主細胞）于培養(yǎng)板上，置℃培養(yǎng)箱～，確保病毒吸附在細胞上。取出培養(yǎng)板，更換細胞維持液。放入培養(yǎng)箱中（℃，）培養(yǎng)，每日在顯微鏡下觀察細胞病變，連續(xù)觀察～，逐孔記錄細胞病變情況。銑饜醞貽龍鵠臚擰奧憑軌簍敘嘮靄標。（）病毒滴度的計算病毒滴度以半數(shù)細胞感染劑量（）表示，的對數(shù)值計算公式如下：對數(shù)值 病變率高于組稀釋度的對數(shù)值 距離比例具體計算步驟如下：）計算細胞病變率。先計數(shù)培養(yǎng)板上不同稀釋度樣本細胞病變發(fā)生與未發(fā)生的孔數(shù)，然后分別計算“細胞病變（）”和“細胞病變（）”的累積總計值。計算“細胞病變（）”累積值時，由稀釋度低樣本組向稀釋度高樣本組累積；“細胞病變（）”累積值則相反，由稀釋度高樣本組向稀釋度低樣本組累積（見表 ）。撾鉬轍魘僑絢綰來誄緊糞償閑勝霽鈁。各稀釋度樣本組“細胞病變（）”累積總計值，除以該稀釋度樣本組“細胞病變（）”與“細胞病變（）”累積總計值之和即為其病變比，由之可得病變率（）（見表 ）。賒調軋憊劌髖糾殯縣鍥峽貢覯駔霧齋。）計算距離比例。距離比例可按下式計算：注：病變率高于 組是指病變率超過的最低組，以下簡稱高于 組；病變率低于組是指病變率低于的最高組，以下簡稱低于組。壘羥贖緙嘸竅碭瀋虯異飽樣瀠漲靂醞。計算舉例：設試驗數(shù)據(jù)如表 。表 某消毒劑對 滅活作用的測定結果樣本接種細胞病變累積值病變比病變率（）稀釋度孔數(shù)細胞病變（）細胞病變（）本例，高于組病變率（）為；低于病變率（）為；高于組稀釋度對數(shù)值為。對數(shù)值 ＋ （）目 的確定所選中和劑是否適用于擬進行的細胞感染法病毒滅活試驗。（）試驗設計原則）通過所設各組試驗結果綜合分析，應可確定所用中和劑是否對測試消毒藥物有良好的中和作用，對試驗用病毒和細胞株是否有害或不良影響。釁璉貢釙壘颯狽猙偵虜諶顆廚邇雛挾。）根據(jù)試驗目的，選擇適宜的病毒株和細胞株。）中和試驗用消毒劑濃度應為最高使用濃度，最短作用時間不得少于。（）實驗分組）中和劑 病毒懸液 → 細胞維持培養(yǎng)基系列稀釋，接種細胞培養(yǎng)觀察中和劑對病毒有無抑制作用。）（消毒劑 中和劑） 病毒懸液 →細胞維持培養(yǎng)基系列稀釋，接種細胞培養(yǎng)觀察中和產(chǎn)物，或未被完全中和的殘留消毒劑對病毒有無抑制作用或對檢測方法有無干擾。）病毒懸液 →細胞維持培養(yǎng)基系列稀釋，接種細胞培養(yǎng)觀察病毒是否可正常生長，并將其結果作為陽性對照值。）未接種病毒的細胞 →培養(yǎng)觀察其生長是否正常。（）病毒懸液定量法中和劑鑒定試驗操作程序）。消毒劑用標準硬水按規(guī)定濃度的倍配制，備用。) 中和劑鑒定試驗分以下組：第 組 吸取 中和劑溶液于試管內，置 ℃177?！嫠。尤?病毒懸液，混合均勻，作用，以細胞維持培養(yǎng)基作系列稀釋，取樣作為第組樣本。畝擱謊為尋瓊淶矚腎驄瑤罷閂壺難辭。第 組 吸取 中和產(chǎn)物（中和劑＋消毒劑溶液）于試管內，置 ℃177?！嫠。傥?病毒懸液，混合均勻，作用，以細胞維持培養(yǎng)基作系列稀釋，取樣作為第組樣本。綿嘮詮櫸異閿欏簫鵡涇嘜囂視薺雋慍。第 組 吸取 細胞維持液于試管內，置 ℃177。℃水浴，再吸加 病毒懸液，混合均勻，作用，以細胞維持培養(yǎng)基作系列稀釋，取樣作為第組樣本。騶鴝記蕢戧滲擺絞絎贍閘選灄鮒隸轉。第 組 將試驗用細胞，加細胞維持液。）將第～組樣本進行病毒滴度測定，觀察第組細胞生長情況。（）病毒載體定量中和劑鑒定試驗操作程序）。）中和劑鑒定試驗分以下組：第 組 吸取中和劑 于無菌試管中，將其置 ℃177?！?水浴，用無菌鑷子夾入片病毒載體片，并使浸透于中和劑內，作用 ，用細胞維持液做系列倍稀釋，取樣作為第組樣本?，F(xiàn)閭襪鎰攆錘惻繕騫凱袞煬歷烴隱徹。第 組 吸取中和產(chǎn)物溶液（以浸有消毒劑的載體置 中和劑內，作用 ） 于無菌試管中，將其置 ℃177?！?水浴，用無菌鑷子夾入片病毒載體片，并使浸透于中和產(chǎn)物溶液中。作用 ，用細胞維持液做系列倍稀釋，取樣作為第組樣本。鐨輝藺敘檔檻豈藶禍緊潔鯨鑊鈉險贅。第 組吸取細胞維持液 于無菌試管中，將其置 ℃177。℃ 水浴，用無菌鑷子夾入片病毒載體片，并使浸透于細胞維持液中。作用，用細胞維持液做系列倍稀釋，取樣作為第組樣本。梟裥蕎獰淪鉦壚蝕頸鍥儲蠍襝嘗隕崳。第組 將試驗用細胞，加細胞維持液。）將第～組樣本進行病毒滴度測定，觀察第組細胞生長情況。（）～記錄試驗結果，試驗重復次。（）評價規(guī)定試驗結果符合以下全部條件，所測中和劑可判為合格：）第、組病毒滴度的誤差率小于，懸液定量法病毒滴度對數(shù)值為～，載體法病毒滴度對數(shù)值為～。輟紺腦誒瀅摟廚議犧異銖張灣蝕隉貪。）第組細胞生長正常。）連續(xù)次試驗取得合格評價。病毒滅活試驗中的物理去除法，首選稀釋法，其次為吸附柱法、分子篩柱法、載體沖洗法。（）分 組）（病毒懸液消毒劑） 除藥處理 →細胞維持培養(yǎng)液系列稀釋，接種培養(yǎng)觀察去除殘留藥物后病毒可否恢復對細胞的感染作用。）病毒懸液 除藥處理 →細胞維持培養(yǎng)液系列稀釋，接種培養(yǎng)觀察除藥處理對病毒滴度有無影響。）病毒懸液 →細胞維持培養(yǎng)液系列稀釋，接種培養(yǎng)觀察病毒生長是否正常，并以該結果作為陽性對照值。）未接種病毒的細胞 →培養(yǎng)觀察細胞生長是否正常。（）懸液定量操作程序）。消毒劑用標準硬水按規(guī)定濃度倍配制備用。）中和劑鑒定試驗分以下組：第組吸消毒劑 于試管內，置 ℃177?！?水浴中經(jīng) 后，吸加 病毒懸液，混勻。待作用至規(guī)定的時間，對此液進行除藥處理，根據(jù)試驗規(guī)定量，吸取最終樣本 （或用細胞維持培養(yǎng)液系列稀釋的樣液），進行隨后的病毒滴度測定。屢潯繾飛獼轄黨諑鐙虜膠錆盧鳥陜憲。第組吸取病毒懸液 ，加 細胞維持培養(yǎng)液，做除藥處理。根據(jù)試驗規(guī)定量，吸取最終樣本（或用細胞維持培養(yǎng)液系列稀釋的樣液），進行隨后的病毒滴度測定。詔弒緇峴瞼慫龜貯溈驏斕窮鐔瓚陳諳。第組吸取病毒懸液 ， 加細胞維持培養(yǎng)液 ，不加消毒劑亦不做任何除藥處理。直接進行病毒滴度測定。鳧沖經(jīng)糧籩賂雞軀鎧潔鵜傘袞鎧隴備。第組向未接種病毒的細胞管內，加入細胞維持培養(yǎng)液進行正常培養(yǎng)。 （）評價規(guī)定試驗結果符合以下全部條件，所測物理除藥法可判為合格：）第組無試驗病毒或僅有少量病毒生長。且明顯少于第組、第組的病毒生長。）第、組病毒生長量相近，二者差異不超過個對數(shù)滴度。 ）連續(xù) 次試驗取得合格評價。）可使用病毒載體，按同樣的原理與操作步驟進行試驗，判定合格標準相同。（）目的驗證各種消毒因子對病毒的滅活效果。（）懸液定量滅活試驗操作程序），低溫保存?zhèn)溆?。）取待測消毒劑，用滅菌硬水稀釋至說明書設定的作用濃度的倍，置 ℃177。℃水浴中備用。）取有機干擾物與等量病毒懸液混合，置 ℃177?！嫠?，加入消毒劑樣品混勻，作用至設定時間，取加入到的中和劑中混勻，用細胞維持液做系列倍稀釋，取樣進行病毒滴度測定。聰駘縶轤終實騭邏顯贍輾諺漬廢陸誚。）陽性（病毒）對照組試驗中，用細胞維持液代替消毒劑，其它同實驗組。）試驗重復次。（）脊髓灰質炎載體定量滅活試驗操作程序）。）取待測消毒劑，用滅菌硬水稀釋至說明書設定的作用濃度，于℃177。℃水浴中備用。）取無菌平皿，按每片 的量，吸取消毒液注入平皿中。）將平皿置 ℃177?！?水浴 后，用無菌鑷子分別取病毒載體片浸沒于消毒液中。）作用至設定時間，取出載體片分別移入含 的中和劑試管中。振打次，進行病毒滴度測定。）直接將病毒載體片加到含細胞維持液的試管中，振打次，進行病毒滴度測定，作為陽性對照組。鯧鋱竊鴇緶諏顫鉆邇凱終殺勻觴際嚕。）試驗重復次。（）平均滅活對數(shù)值的計算平均滅活對數(shù)值按下式計算：設陽性（病毒）對照組平均病毒感染滴度（）的為，試驗（消毒）組平均病毒感染滴度（）為。堿賢矯攝膽嘮闊銻愷緊弳韻鏢鷹階証。平均滅活對數(shù)值 －（）評價規(guī)定）懸液定量殺滅試驗中，殺滅對數(shù)值≥，陽性對照組病毒滴度對數(shù)值在～ 之間為消毒合格。）載體定量滅活試驗中，殺滅對數(shù)值≥， 陽性對照組病毒滴度對數(shù)值在～ 之間為消毒合格。（）目 的測定消毒劑對艾滋病病毒滅活所需的劑量，以驗證對該病毒污染物消毒的實用劑量。（）實驗原理 用細胞感染法測定消毒劑作用前后（或試驗組與對照組）樣本中 的量。以細胞病變作為判斷指標，確定各組病毒的感染滴度，計算消毒劑對 的滅活對數(shù)值。闋蘆畫腎藎覺鎪鐿賚鍥驛縛蟬礪陰吳。（）安全防護試驗中要求采取嚴密防護措施。我國規(guī)定所有接觸 的試驗均需在生物安全三級（ ， ）實驗室內進行，并制定有相應的安全防護措施。在 滅活試驗時，必須嚴格按照有關安全規(guī)定進行。溝礬爺銦蟈剛銪霽寧棄貝嚨渙錫陽覬。（）實驗分組）試驗組根據(jù)所測消毒劑對其他微生物的殺滅或滅活劑量估計，設立適宜的濃度與作用時間組（不少于個濃度，個作用時間），對作用時間的設計應