雙向凝膠電泳技術(shù)ppt課件-資料下載頁
2025-05-12 06:52本頁面
【正文】 ng蛋白，但可以染色多種蛋白質(zhì)，并能與蛋白量呈兩個(gè)最高數(shù)量級的線性關(guān)系。用考馬斯亮蘭染色的蛋白點(diǎn)成藍(lán)色，可以用可見光掃描儀捕獲膠圖。熒光染色法是一種終點(diǎn)染色方法，可以檢測到大約 1ng的蛋白點(diǎn)，熒光染色法與蛋白量呈 3個(gè)最高數(shù)量級的線性關(guān)系，需用熒光掃描儀顯示用熒光染色法染色的蛋白點(diǎn)。 分離蛋白質(zhì)的檢測與匹配分析 目前常用的圖像分析軟件有 PDQUEST(BioRad）、MELANIEⅡ （ SIB,GenBio）、 Irnagemaster（ APB)、Advanced 2D Software（ Phoretix）和 IIT Ivestigator(GSI),圖像分析軟件能提供綜合管理各種分離和分析過程所必須的控制和分析的功能。 2D PAGE分析軟件確定并定量雙向凝膠上蛋白點(diǎn)，去除背景方式，匹配相關(guān)膠圖，比較相關(guān)膠圖上相應(yīng)蛋白點(diǎn)強(qiáng)度，準(zhǔn)備顯示報(bào)告的凝膠數(shù)據(jù)以及輸出膠圖信息到數(shù)據(jù)庫。圖像分析軟件也能指導(dǎo)手工或點(diǎn)自動(dòng)切割機(jī)械手進(jìn)行膠上蛋白點(diǎn)的切割，以作進(jìn)一步的分析。 樣品的溶解直接關(guān)系到分離的分辨率，為使盡可能多的蛋白質(zhì)溶解，必須完全破壞分子間的相互作用，把蛋白質(zhì)復(fù)合物解聚和變性為單體形式，使其在整個(gè)分離過程以多肽鏈形式存在，同時(shí)要避免對蛋白質(zhì)的任何化學(xué)修飾。一些疏水蛋白尤其是膜蛋白很難溶解，為了促進(jìn)其溶解，常加入一些增溶劑如變性劑、表面活性劑、還原劑等，變性劑的作用是破壞氫鍵，使蛋白質(zhì)解折疊和變性。它不僅作用于蛋白質(zhì)，還可用于周圍溶劑（通常是水）。尿素是 2DPAGE中最常用的變性劑，其作用是可逆的，在凝膠中的濃度必需保持在8mol/L以上。當(dāng)尿素與硫脲結(jié)合使用時(shí)，極大地提高了膜蛋白的溶解，由于硫脲難溶于水，高濃度的尿素能促進(jìn)硫脲的溶解，因此2mol/L硫脲常在 57mol/L尿素濃度下使用，硫脲濃度大于 2mol/L會(huì)降低等電聚焦 (IEF)分辨率，可能是其抑制 SDS蛋白質(zhì)結(jié)合的緣故。
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