《雙向凝膠電泳技術(shù)》ppt課件-全文預(yù)覽
【正文】 膠，以防電泳時滑動或漂移。為減少酰胺基組的烷基化，最好在 pH89之間進(jìn)行還原和烷基化。膠條平衡包括兩個簡單的步驟，每步 1015分鐘，第一步是將 IEF膠在 375mmol/L TrisHCl 液（含 2%SDS、 1%DTT或 6mol/L尿素和 30%甘油）中浸泡 1015分鐘，尿素和甘油是用于緩沖電滲效應(yīng)，提高蛋白質(zhì)從第一向到第二向的轉(zhuǎn)移率。 聚焦完成后，膠條既可以在中間電壓 5001000V下短時間保持，便于隨時進(jìn)行第二向的平衡，也可以置于 80℃冰箱中進(jìn)行長期保存。 IEF具有分辨率高（ ）、抵消擴(kuò)散作用、可使?jié)舛容^低的樣品達(dá)到高度濃縮等優(yōu)點(diǎn)，不僅可以用來分離兩性大分子，還可以通過測定等電點(diǎn)來鑒定蛋白質(zhì)。 細(xì)胞處理： 對于組織細(xì)胞，首先需將其破碎，盡可能地將蛋白質(zhì)組分溶解在緩沖液中，以便在適當(dāng)?shù)碾娪緱l件下分離。除增加雙向凝膠電泳靈敏度的方法外，最有希望的還是把介質(zhì)輔助的激光解吸 /離子化質(zhì)譜用到 PVDF膜上，但當(dāng)前的技術(shù)還不足以檢出拷貝數(shù)低于 1000的蛋白質(zhì)。因此，雙向電泳被廣泛應(yīng)用與農(nóng)業(yè)，醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域。在蛋白樣品裂解時，應(yīng)以溶解盡可能多的蛋白質(zhì)和保持在整個雙向電泳過程中蛋白質(zhì)的溶解性為主要目標(biāo)。 制備原則： 由于雙向電泳所分析樣品的多樣性，沒有一種通用的制備方法適用于各種樣品。第一向?yàn)榈入娋劢梗?Isoelectric facusing， IEF)電泳，其基本原理是利用蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)不同進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離。 雙向凝膠電泳技術(shù) twodimensional gel electrophoresis technology (2DE) ? 定義一 ：以凝膠為載體的雙向電泳。根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量的差異，連續(xù)進(jìn)行成垂直方向的兩次電泳。 蛋白質(zhì)定量和上樣： （ 1）固相 PH梯度干膠條（ immobilinePH
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