功能基因組學(xué)ppt課件-資料下載頁
2025-05-12 06:35本頁面
【正文】 RNA形成雙鏈 RNA特異性抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的現(xiàn)象，存在于從低等的線蟲到人類培養(yǎng)細(xì)胞等多種有機(jī)體。 RNAi相關(guān)技術(shù)是研究轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的有效工具，可用于功能基因組學(xué)研究以及基因治療等臨床用途。 RNAi 研 究 史 十幾年前， Rich Jensen 在矮牽?；ㄖ邪l(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因沉默 七年前， researchers Guo 和 Kemphues 注入反義 RNA及正義鏈 RNA都能抑制線蟲 par1 基因的表達(dá)；三年后， Fire等注入雙鏈 RNA到線蟲中發(fā)現(xiàn)比注入單鏈更有效，隨后發(fā)展了通過 RNAi進(jìn)行線蟲基因敲除的策略。 近年來，顯微注射，基因槍，基因工程手段誘導(dǎo) RNAi也成為果蠅研究中的反向遺傳學(xué)工具。 2022年 Elbashir等 《 Nature》 上首次報(bào)道通過 21個(gè)核苷酸的 siRNA成功地在哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞中誘導(dǎo)特異性基因沉默。隨后，在小鼠等多種細(xì)胞中也取得了成功。 RNAi 機(jī)制模式圖 ? 核心技術(shù)： siRNA（ Small interfering RNA）的設(shè)計(jì)與合成 ? siRNA的標(biāo)記 ? siRNA的轉(zhuǎn)染 ? RNAi的檢測（核酸及蛋白水平） RNA干擾技術(shù) ： 哺乳動(dòng)物： 2123bp dsRNA 其它生物：更長的片段 dTdT（ UU） （ UU） dTdT siRNA的設(shè)計(jì) （選擇 siRNA靶位點(diǎn)） ?從轉(zhuǎn)錄本 AUG起始密碼子開始，搜尋下游 AA序列，記錄跟每個(gè) AA 3’端相鄰的 19個(gè)核苷酸作為候選的 siRNA靶位點(diǎn)；根據(jù) 5‘和 3’非翻譯區(qū)（ UTR)及靠近起始密碼子（ 75個(gè)堿基之內(nèi)）等富含調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域來設(shè)計(jì) siRNA。 ?將候選靶位點(diǎn)與相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫比較，去掉哪些與其它編碼序列同源的靶序列。 ?設(shè)計(jì)陰性對(duì)照：陰性對(duì)照 siRNA應(yīng)與 siRNA的核苷酸組成相同但沒有與基因組明顯同源的序列。一般通過改變 siRNA核苷酸順序并經(jīng)同源序列比較確證而得。 siRNA的設(shè)計(jì) RNAi技術(shù)的應(yīng)用 ? 功能基因組學(xué) 蛋白表達(dá)調(diào)控，蛋白功能研究 … ? 基因治療 候選治劑；藥物靶位點(diǎn)鑒定 ? 轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理研究 RNAi技術(shù)應(yīng)用舉例－功能研究 Anna M. Krichevsky* and Kenh S. Kosik RNAi functions in cultured mammalian neurons PNAS u September 3, 2022 宿主：大鼠皮層和海馬細(xì)胞 靶基因：內(nèi)源： MAP2 /YB1 外源： pEGFP/ dsRed2 報(bào)告基因 21nt GFP siRNA 在原代腦皮層神經(jīng)元中的 RNAi 21nt MAP2 siRNA在神經(jīng)元中的 RNAi actinbound phalloidin (red）
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