劉寶dna甲基化ppt課件-資料下載頁(yè)
2025-05-12 02:48本頁(yè)面
【正文】 H/M primer (5μ M) Taq DNA polymerase (5U/μL ) PCR water DNA 模板（ 預(yù)擴(kuò) 增稀 釋產(chǎn) 物） 2μLTotal volume 15μL表 4AFLP選擴(kuò) PCR體系v PAGE電泳? 電泳裝置圖? 玻璃板分為大板和小板 (上部凹形 )自來(lái)水清洗95％酒精擦兩遍硅化：均勻擦涂親和硅化試劑于大板的一面，剝離硅化試劑于小板的一面5分鐘后， 95％酒精再擦兩遍，裝板灌膠 圖 8PAGE電泳系統(tǒng)? 尿素 PAGE膠配制灌膠前，加入四甲基乙二胺（ TEMED） 30μL， 10%過(guò)硫酸銨（ APS） 160μl，混勻，立即灌膠。灌膠時(shí)玻璃板傾斜 15度。膠聚合 1小時(shí)以上才可以電泳。? 電泳： 電泳儀采用 北京市六一儀器廠 DYY10C型。電泳裝置使用北京君意東方電泳設(shè)備有限司測(cè)序裝置新 JYCX2B型。電泳緩沖液為 1xTBE， 85W預(yù)電泳 1小時(shí)，膠板的溫度達(dá)到 55?C。點(diǎn)樣前， DNA樣品 95?C變性 5分鐘，立即冰浴，加 3xloadingbuffer,混勻，瞬時(shí)離心，點(diǎn)樣量 16μL， 恒功率 55W電泳到指定位置，即可卸板染色。尿素 (分析 純 ) 10xTBE 4mL40% 丙 烯酰 胺膠 貯 液 (Acrylamide/Bis 19:1)16mL超 純 水 加到 總 體 積 40mL灌膠圖 電泳圖表 5PAGE膠配方v 銀染操作? 電泳結(jié)束后，輕輕分離兩塊玻璃板，將附著膠的大板置于固定 /終止液中，輕搖20分鐘，直至指示染料消失。? 凝膠洗滌，回收固定 /終止液，用雙蒸水洗滌凝膠 3次，每次至少 2分鐘，凝膠板從水中取出后，豎起空水 15秒。? 染色，將膠板移至染色液中，輕搖 30分鐘。? 凝膠顯影，將染色后的膠板放入雙蒸水中 510秒，迅速取出并豎起控水，隨后把膠板放入預(yù)冷的一半顯影液中，充分搖動(dòng)，當(dāng)出現(xiàn)第一批條帶后，倒入另一半顯影液，輕搖至條帶全部出現(xiàn)。（注意：從放入水中到放入顯影液中，時(shí)間不應(yīng)超過(guò) 10秒。）? 終止顯影，在顯影液中直接添加等體積的固定 /終止液（第一步中用過(guò)的），停止顯影并固定影像。? 固定完全后，即醋酸和碳酸鈉反應(yīng)完全 (溶液不再有二氧化碳產(chǎn)生 )，用雙蒸水洗滌凝膠 2次，每次至少 2分鐘，凝膠板從水中取出后，豎起控水涼干備用。 （第十九天）圖 9PAGE膠銀染v預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果? 同一位置處不同樣品電泳條帶的不同，顯示此處胞嘧啶甲基化狀態(tài)不同。 （第二十天）圖 10預(yù)期結(jié)果 PAGE電泳圖v注意事項(xiàng)與建議? 五氮胞苷（ 5azacytidine； MW:）：粉末于 20℃ 保存，見(jiàn)光或遇熱分解，使用時(shí)配母液于 4℃ 保存，保存時(shí)間不宜超過(guò)半個(gè)月；? 丙烯酰胺為劇毒試劑，配制、使用時(shí)必須按有關(guān)規(guī)程做好個(gè)人防護(hù)；思考題v 5’氮胞苷為什么能使 DNA甲基化水平降低？v MSAP的原理是什么？v 如何分析 MSAP電泳圖？參考文獻(xiàn) v [1] Razin A, Cedar H. DNA methylationBiochemistry and Biological Significance. J Chromatogr, 1992, 581(1): 3140.v [2] Flavell R B. Inactivation of gene expression in plants as a on sequence of specific sequence duplication. Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 91:34903496.v [3] Ng , Bird A. DNA methylation and chromatin modification. Curr Opin Ge Dev, 1999, 9(2): 158－163v [4] Stokes T. Methylation of a different kind. Trends Plant Sci, 2022, 6(11):50351
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