dna序列測(cè)定ppt課件-資料下載頁(yè)
2025-05-05 12:09本頁(yè)面
【正文】 C與 T有同樣速率 C 2MNaCl，聯(lián)氨處理方法同上， 100分鐘，此時(shí)， T的破壞被抑制，只有 C被破壞釋放 同上，只在 C處斷裂DNA鏈 在 4種反應(yīng)體系中，化學(xué)試劑特異地?cái)嗔?DNA的機(jī)制是： G反應(yīng) 硫酸二甲酯（ DMS）使 GN7甲基化，其后斷開(kāi)了 C8C9間的化學(xué)鍵，哌啶置換了被修飾鳥(niǎo)嘌呤與核糖的結(jié)合。 G+A反應(yīng) （哌啶）甲酸使嘌呤環(huán)上氮原子質(zhì)子化，削弱了嘌呤脫氧核糖核苷酸和腺嘌呤脫氧核糖核苷酸的糖苷鍵，然后哌啶置換了嘌呤。 T+C反應(yīng) 肼斷開(kāi)了嘧啶環(huán)，產(chǎn)生堿基片段被哌啶置換。 C反應(yīng) 在 NaCl存在時(shí)，只有 C才能與肼發(fā)生反應(yīng)，隨后，被修飾的胞嘧啶被哌啶置換。 二、堿基特異性修飾及裂解 反應(yīng)體系 堿基修飾試劑 堿基修飾反應(yīng) 主鏈斷裂試劑 斷裂點(diǎn) G 硫酸二甲酯 鳥(niǎo)嘌呤甲基化 六氫吡啶 G G+A 甲酸 脫嘌呤作用 六氫吡啶 G和 A C+T 肼 嘧啶開(kāi)環(huán) 六氫吡啶 C和 T C 肼（加鹽） 胞嘧啶開(kāi)環(huán) 六氫吡啶 C （一） 限制酶消化待測(cè) DNA，得到長(zhǎng)度為 100200bp的一組片段，純化回收每 1個(gè)片段作為測(cè)序材料。 （二） 堿性磷酸酶處理消除 5’磷酸。 （三） 多核苷酸酶催 32PdNTP標(biāo)記（ 5’OH）末端。 （四） 使標(biāo)記片段變性為單鏈。 （五） 分成 45個(gè)反應(yīng)體系，按上述程序（表或 4個(gè)機(jī)制）化學(xué)處理，嚴(yán)格控制反應(yīng)條件。（使得平均每 1個(gè) DNA分子只有 1個(gè)位置被斷裂，這種斷裂是隨機(jī)的，如 G反應(yīng)，則在 DNA鏈上任意位置 G斷裂）， DNA鏈上每 50100堿基只有 1個(gè)被裂解，這樣，每個(gè)反應(yīng)中雖然都在同一核苷酸處斷裂DNA鏈，但由于堿基位置不同，產(chǎn)生 1組不同長(zhǎng)度的 DNA片段。其長(zhǎng)度可由幾個(gè)核苷酸到接近待測(cè) DNA全長(zhǎng)。 （六） 電泳 （七） 放射自顯影 （八） 4個(gè)反應(yīng)管統(tǒng)一閱讀， DNA4個(gè)堿基每個(gè)位置都有一個(gè)相應(yīng)的片段，待測(cè) DNA全部核苷酸序列就可直接讀出。 二、化學(xué)法測(cè)序的基本步驟 （三、四略講） 三、化學(xué)法的優(yōu)點(diǎn) 化學(xué)法沒(méi)有末端終止法應(yīng)用廣泛，但有一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)，即所測(cè)序列來(lái)自原 DNA分子而不是酶促合成反應(yīng)所產(chǎn)生的拷貝，因此利用化學(xué)法可以對(duì)合成的寡核苷酸進(jìn)行測(cè)序，可以分析諸如甲基化等DNA修飾的情況，不能通過(guò)化學(xué)保護(hù)及修飾干擾實(shí)驗(yàn)來(lái)研究 DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)與 DNA的相互作用。 三、化學(xué)裂解法的特點(diǎn) 不需酶催化 5 ′和 3 ′端均可標(biāo)記，可從兩方向測(cè)同一 DNA 操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、分辨率較低 四、化學(xué)法讀序 化學(xué)法測(cè)序放射自顯影圖譜的識(shí)讀，較末端法更復(fù)雜一些，這是因?yàn)榛瘜W(xué)裂解反應(yīng)并不完全是堿基特異性的，每組測(cè)序圖譜為 4或 5條垂直的階梯帶， AC反應(yīng)可以不做。該片從膠底部一個(gè)個(gè)向頂部讀， G+A和C+T兩列中含有所有相差一個(gè)堿基的 DNA片段。如果 G+A中出現(xiàn) 1條帶就看 G列中是否有同樣大小的帶，若有即為 G堿基，無(wú)則為 A堿基；同理，C+T中則檢查 C列中有無(wú)同樣大小條帶，有即為 C，無(wú)則為 T。在做了AC反應(yīng)時(shí)，出現(xiàn)較深的帶時(shí)，可以幫助確定為 A堿基。化學(xué)法必須 4或5個(gè)反應(yīng)管統(tǒng)一閱讀， DNA中 4個(gè)堿基每個(gè)位置都有 1個(gè)相應(yīng)的片段，待測(cè)的 DNA全部序列可直接讀出。（專業(yè)技術(shù)人員） 化學(xué)法測(cè)序采用 32P標(biāo)記 DNA進(jìn)行，條帶會(huì)較末端法更模糊，更寬，由于分辨率不足，從單塊凝膠上能得到可靠序列數(shù)量約為 200300bp以內(nèi)。讀序常見(jiàn)問(wèn)題及解決辦法參見(jiàn)分子克隆 P665。 末端法讀序（分子克隆 P640） 第三節(jié) DNA測(cè)序自動(dòng)化和大規(guī)模測(cè)序 特點(diǎn) 原理同末端終止法 標(biāo)記物為熒光染料 激光掃描自動(dòng)測(cè)序 結(jié)果清晰、準(zhǔn)確、分辨率高 測(cè)序速度快 200bp/h DNA自動(dòng)測(cè)序與手工測(cè)序的不同點(diǎn) 標(biāo)記物不同：手工測(cè)序采用放射性核素標(biāo)記，而自動(dòng)測(cè)序采用 4種熒光染料分別標(biāo)記 ddNTP或標(biāo)記引物 加樣方式不同：手工測(cè)序，一個(gè)樣品的 4個(gè)測(cè)序反應(yīng)物分別在不同泳道進(jìn)行，而自動(dòng)測(cè)序可在一個(gè)泳道內(nèi)電泳 檢測(cè)手段不同：手工測(cè)序采用放射自顯影，從 4種寡聚核苷酸的梯子形圖譜中讀出 DNA序列，而自動(dòng)測(cè)序則采用激光掃描器同步掃描，計(jì)算機(jī)進(jìn)行閱讀和編輯
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