dna重組ppt課件(2)-資料下載頁(yè)
2025-05-05 12:09本頁(yè)面
【正文】 準(zhǔn)確度比 Tth DNA聚合酶高 2倍 Taq DNA聚合酶， Pwo DNA聚合酶 將喜溫性細(xì)菌中此酶的基因轉(zhuǎn)入 ，市售產(chǎn)品為此酶基因在 產(chǎn)物。 Tth DNA聚合酶， . DNA聚合酶 直接從發(fā)現(xiàn)它們的微生物中提取 靶 DNA 和模板 靶 DNA： 待擴(kuò)增的特定 DNA雙鏈片段。應(yīng)該知道其兩端 20～ 30bp的核苷酸序列，供設(shè)計(jì)一對(duì)引物之用。 模板： 一條單鏈的 DNA片段 PCR引物 ? PCR擴(kuò)增引物： 是指與待擴(kuò)增 DNA區(qū)域兩端序列互補(bǔ)的人工合成的寡核苷酸短片段，其長(zhǎng)度通常在 15～ 30個(gè)核苷酸之間。它包括引物 1和引物 2。 ? 引物設(shè)計(jì)的基本原則 是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性，同時(shí)盡可能抑制非特異性擴(kuò)增。 具體的設(shè)計(jì)原則： ? 引物 3’端必須具有游離 OH基團(tuán)； ? 引物長(zhǎng)度 2030個(gè)核苷酸， G+C含量一般為40%~60%，四種堿基的分布最好隨機(jī)，不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在； ? 引物應(yīng)避免回文結(jié)構(gòu)，同時(shí)引物之間也不能有互補(bǔ)性 ，避免形成引物二聚體； ? 5’端可以修飾，如加酶切位點(diǎn)序列；標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等，這對(duì)擴(kuò)增的特異性影響不大。但 3′端絕對(duì)不能進(jìn)行任何修飾，因?yàn)橐锏难由焓菑?3′端開(kāi)始的。 ? 擴(kuò)增編碼區(qū)域時(shí)，引物 3′端不要終止于密碼子的第 3位，因?yàn)槊艽a子第 3位易發(fā)生 簡(jiǎn)并 ，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率 ； ? 引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過(guò) 70%或有連續(xù) 8個(gè)互補(bǔ)堿基同源 PCR原材料 dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP 或修飾過(guò)的核苷酸 PCR緩沖液 140mM TrisHcl（ ） 、 4 ～ 8mM MgCl 40mM (NH4)2SO 30μg/ml BSA(無(wú)核酸酶 )、 16mM DTT PCR循環(huán)的溫度和時(shí)間 （ 1）變性（快速高溫） 溫度： 90 ～ 95 ℃ ，多采用 94 ℃ 時(shí)間： 20s （ 2）復(fù)性 溫度： 取決于引物長(zhǎng)短和 GC含量 如長(zhǎng)度 20個(gè)核苷酸， GC含量 50% → 55 ℃ ； 如長(zhǎng)度 12 ～ 15個(gè)核苷酸 → 40～ 45 ℃ ； 時(shí)間： 20s （ 3）延伸 溫度： 70 ～ 75 ℃ 時(shí)間： 隨擴(kuò)增 DNA片段長(zhǎng)度而定 1000bp→1min ， 150bp甚至不需考慮延伸時(shí)間 ?平臺(tái)效應(yīng)出現(xiàn)的遲早主要取決于起始模板的拷貝數(shù)、所用的 DNA聚合酶的性能及底物dNTP的濃度等多種因素。 PCR擴(kuò)增的平臺(tái)效應(yīng) ? 在 PCR反應(yīng)中，當(dāng)引物－模板與 DNA聚合酶達(dá)到一定比值時(shí)， DNA聚合酶催化的反應(yīng)趨于飽和，會(huì)出現(xiàn)“平臺(tái)效應(yīng)”，即PCR反應(yīng)產(chǎn)物不再增加。 三、 PCR擴(kuò)增 DNA片段的方法 四、常用的 DNA片段 PCR擴(kuò)增系統(tǒng) 遺傳密碼 64個(gè)密碼子 61個(gè)代表各種氨基酸（ AUG起始密碼） 3個(gè)密碼子為終止子（ UAA、 UAG、 UGA）
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