dna序列測(cè)定ppt課件-wenkub.com
2025-05-02 12:09 本頁(yè)面
【正文】 （專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員） 化學(xué)法測(cè)序采用 32P標(biāo)記 DNA進(jìn)行，條帶會(huì)較末端法更模糊，更寬，由于分辨率不足，從單塊凝膠上能得到可靠序列數(shù)量約為 200300bp以?xún)?nèi)。該片從膠底部一個(gè)個(gè)向頂部讀， G+A和C+T兩列中含有所有相差一個(gè)堿基的 DNA片段。其長(zhǎng)度可由幾個(gè)核苷酸到接近待測(cè) DNA全長(zhǎng)。 （三） 多核苷酸酶催 32PdNTP標(biāo)記（ 5’OH）末端。 T+C反應(yīng) 肼斷開(kāi)了嘧啶環(huán)，產(chǎn)生堿基片段被哌啶置換。 某些試劑能修飾或破壞 DNA鏈上特定核苷酸的堿基進(jìn)而使 N糖苷鍵斷裂，暴露出的糖環(huán)以 β消除反應(yīng)，在 3’和 5’位上斷裂磷酸二酯鍵。 將各克隆用于測(cè)序。 （五）用于測(cè)序的變性凝膠電泳 膠長(zhǎng) 40cm，厚度均勻 4~8%丙烯酰胺 7mol/L尿素 三、 Sanger法測(cè)序主要反應(yīng)（實(shí)習(xí)講義 P138） （一）制膠 （二）模板變性（雙鏈） （三）測(cè)序反應(yīng) 模板引物退火 鏈延伸、鏈標(biāo)記、鏈終止反應(yīng) 上樣電泳 讀片（序） （分子克隆 P640） （必須經(jīng)過(guò)實(shí)踐才能獲得技巧） 四、大片段 DNA的測(cè)序方法 （一）隨機(jī)法 超聲波處理：將 DNA隨機(jī)斷裂成一組相互重疊的300~900bp片段，電泳回收 300~600bp片斷作亞克隆 DNaseI切割：將 DNA隨機(jī)切割成一組相互重疊的片段，作亞克隆 限制酶消化：限制酶將 DNA切割為含粘端的 DNA片段，作亞克隆將上述含不同子片段的亞克隆擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序 （二）嵌套缺失法 將待測(cè) DNA與 M13mp載體相連，構(gòu)成重組體。 （四）放射性同位素標(biāo)記的 dNTP 傳統(tǒng) 32PdNTP，由于 32P衰變過(guò)程中產(chǎn)生高能的 β射線，導(dǎo)致放射自顯影圖譜條帶擴(kuò)散，分辨率低，限制了識(shí)讀序列的數(shù)量。活性非常穩(wěn)定，具有很高的鏈延伸能力和極快的聚合反應(yīng)速度，是測(cè)定較長(zhǎng) DNA序列的首選酶。 （三） DNA聚合酶 大腸桿菌 DNA聚合酶 I Klenow大片段 Klenow大片段 DDDPI是由分子量 109KD一條多肽鏈組成，此酶可被枯草桿菌蛋白酶分解成 2個(gè)片段， 1個(gè)片段分子量為 76KD，有聚合酶，3’→5’ 外切酶活力，此片段稱(chēng)為 Klenow片段，另一片段 34KD，有 5’→ 外切酶活力。 BAL31還有較弱的單鏈特異內(nèi)切酶活性，與核酸酶 S1相似，降解ssDNA或 ssRNA形成 5’磷酸末端的單或寡核苷酸酶片段，能從 DNA片段中切除單鏈尾巴，產(chǎn)生平頭末端。核酸酶 BAL31和核酸外切酶 III，均可以達(dá)到連續(xù)刪切的目的。（并可制備只與外源 DNA任意 1條 DNA鏈互補(bǔ)的探針）。 （ 2） M13mp18和 M13mp19是一對(duì)載體，它們有相同的 13個(gè)多克隆位點(diǎn)，但方向相反。 2） M13mp18和 M13mp19載體 （ 1） mp系列載體特點(diǎn)： ① 都是從同一重組 M13mp1改造而來(lái)。 在感染過(guò)程中， M13并不殺死細(xì)胞，但細(xì)胞的生長(zhǎng)受到某種程度抑制。它感染細(xì)菌（宿主菌）呈溶原狀態(tài)生長(zhǎng)，在菌體內(nèi)形成過(guò)渡階段雙鏈環(huán)狀復(fù)制型 DNA（ Replicative form DNA， RF DNA），在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以擴(kuò)增至數(shù)百個(gè)拷貝。同一待測(cè)的 DNA片段分別克隆到這兩個(gè)載體中，用一通用引物進(jìn)行測(cè)序。然后分別測(cè)定每個(gè)片段的順序。小量制備質(zhì)粒 DNA常被寡核苷酸小分子，核糖核苷酸及 DNA聚合酶抑制劑所污染，前兩者可被用作隨機(jī)引物，造成假象和強(qiáng)終止現(xiàn)象，使測(cè)序膠含糊不清。這些引物同樣也可用于 PUC質(zhì)粒的 DNA進(jìn)行“雙鏈”測(cè)序，并且已經(jīng)商品化。 在許多情況下可將靶 DNA片段克隆于 M13噬菌體或噬菌粒載體，以取得單鏈 DNA分子作為模板。（ P255，圖 102） （三） Sanger雙脫氧鏈終止法的原理 在 DNA合成時(shí)，利用 ddNTP與 dNTP競(jìng)爭(zhēng)摻入到新生的 DNA鏈上使鏈終止的原理。 熱循環(huán)測(cè)序 使極少數(shù)測(cè)序產(chǎn)物線性放大。 高負(fù)荷， 1塊膠可測(cè)16個(gè)樣品； 機(jī)讀不
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