dna序列測(cè)定ppt課件(編輯修改稿)
2025-06-01 12:09 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 又產(chǎn)生大量的 ssDNA，它被 1個(gè)外殼蛋白包裝成成熟的噬菌體，在細(xì)胞生長(zhǎng)的過(guò)程中，子代噬菌體顆粒釋放出來(lái)，這是 M13不同于其他噬菌體的特點(diǎn)。每 ml培養(yǎng)液沉淀的噬菌體可提取 510mgssDNA，產(chǎn)量是很高的。用作克隆載體， M13有 1個(gè)得天獨(dú)厚的優(yōu)點(diǎn)，即可產(chǎn)生大量含有外源 DNA其中 1條鏈的 DNA分子，后者可在下列工作中充作模板： （ 1）末端終止法測(cè)序 （ 2）制備“放標(biāo)”單鏈用于雜交 DNA探針 （ 3）利用寡核苷酸進(jìn)行定點(diǎn)誘變。 2） M13mp18和 M13mp19載體 （ 1） mp系列載體特點(diǎn)： ① 都是從同一重組 M13mp1改造而來(lái)。 ② 在基因 IIIV（ 500bp， 570bp左右）之間有 1個(gè)多克隆位點(diǎn)（ multiple cloning sites， MCS）可供外源基因插入。 ③ 該區(qū)域（ MCS）插入了 1小段 ，有 β半乳糖苷酶基因（ LacZ）的調(diào)控序列及其 N端 146個(gè) aa編碼信息，它與宿主菌（含 LacZ）α互補(bǔ)，形成有活性的 β半乳糖苷酶，使平板上底 Xgal生色成藍(lán)噬菌斑，當(dāng)外源基因插入 MCS，破壞了 α互補(bǔ)，幾乎無(wú)一例外生成無(wú)色（白）噬斑。這是一種非常有效的克隆篩選選擇性標(biāo)志。 （ 2） M13mp18和 M13mp19是一對(duì)載體，它們有相同的 13個(gè)多克隆位點(diǎn)，但方向相反。（當(dāng) RF DNA被兩種限制酶切割后， M13mp18和M13mp19輕易不能重新環(huán)化，當(dāng)連接混合液中含外源匹配末端 dsDNA片段時(shí)方閉合成環(huán)，這一片段在二者中將以互為相反的兩個(gè)方向插入。這樣M13mp18正鏈中含有外源 DNA的一條鏈，而在 M13mp19正鏈中含外源DNA的另一條鏈）。所以 M13mp18和 M13mp19作為一對(duì)載體可用同一通用引物，（從所插入 DNA片段任一端開(kāi)始），測(cè)定互為相反兩條鏈的 DNA序列。（并可制備只與外源 DNA任意 1條 DNA鏈互補(bǔ)的探針）。（分子克隆 P202）。 定向連續(xù)次級(jí)克隆待測(cè)大片段 DNA片段 測(cè)定數(shù) kb的 DNA序列時(shí)，可以建立一系列一端刪切 200300bp的DNA片段次級(jí)克隆。對(duì)它們分別測(cè)序，就可以連續(xù)讀出該大片段 DNA的全部序列。核酸酶 BAL31和核酸外切酶 III，均可以達(dá)到連續(xù)刪切的目的。 核酸酶 BAL31是從乳白短桿菌（ Brevibacterium albidum）細(xì)菌中分離。它能以漸進(jìn)的方式將線型 DNA分子的 3’， 5’兩端同時(shí)降解，形成小的寡核苷酸片段或單核苷酸。底物可以是帶延伸末端的，也可以是平頭末端的 dsDNA，對(duì) 3’， 5’兩端降解有同樣性，此酶要求 Ca2+作輔因子，以 EDTA作螯合劑，可使該酶失活。 BAL31還有較弱的單鏈特異內(nèi)切酶活性，與核酸酶 S1相似，降解ssDNA或 ssRNA形成 5’磷酸末端的單或寡核苷酸酶片段，能從 DNA片段中切除單鏈尾巴，產(chǎn)生平頭末端。核酸酶 S1是從米曲霉（ Aspergillus Oryze）中分離的。 外切核酸酶 III是一種從 ，從 dsDNA的 3’OH末端降解產(chǎn)生 5’單核苷酸的外切酶。（此外，外核酸酶 III還有內(nèi)核酸酶，RnaseH和 3’磷酸酶的活性。 （三） DNA聚合酶 大腸桿菌 DNA聚合酶 I Klenow大片段 Klenow大片段 DDDPI是由分子量 109KD一條多肽鏈組成，此酶可被枯草桿菌蛋白酶分解成 2個(gè)片段， 1個(gè)片段分子量為 76KD，有聚合酶，3’→5’ 外切酶活力，此片段稱為 Klenow片段，另一片段 34KD，有 5’→ 外切酶活力。 此酶是末端終止法最早采用的酶，用它進(jìn)行測(cè)序常常產(chǎn)生較高的本底和假帶，催化鏈延伸反應(yīng)的能力也較差，通常只能讀出距引物 250個(gè)核苷酸以內(nèi)的序列。此酶價(jià)格便宜，容易獲得，對(duì)于已知序列 DNA次級(jí)克隆的鑒定仍有應(yīng)用價(jià)值。 測(cè)序酶（ Sequenase） 測(cè)序酶是經(jīng)過(guò)改造的 T7噬菌體 DNA聚合酶，消除了 3’→5’ 外切酶活性?；钚苑浅７€(wěn)定，具有很高的鏈延伸能力和極快的聚合反應(yīng)速度，是測(cè)定較長(zhǎng) DNA序列的首選酶。該酶及名稱是 HSB公司的專利。試劑盒已商品化。 TaqDNA聚合酶 Taq酶用于序列測(cè)定，除具有很好的鏈延伸性能外，還可以在高溫
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