dna序列測定ppt課件(編輯修改稿)
2025-06-01 12:09 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 又產(chǎn)生大量的 ssDNA，它被 1個外殼蛋白包裝成成熟的噬菌體，在細胞生長的過程中，子代噬菌體顆粒釋放出來，這是 M13不同于其他噬菌體的特點。每 ml培養(yǎng)液沉淀的噬菌體可提取 510mgssDNA，產(chǎn)量是很高的。用作克隆載體， M13有 1個得天獨厚的優(yōu)點，即可產(chǎn)生大量含有外源 DNA其中 1條鏈的 DNA分子，后者可在下列工作中充作模板： （ 1）末端終止法測序 （ 2）制備“放標”單鏈用于雜交 DNA探針 （ 3）利用寡核苷酸進行定點誘變。 2） M13mp18和 M13mp19載體 （ 1） mp系列載體特點： ① 都是從同一重組 M13mp1改造而來。 ② 在基因 IIIV（ 500bp， 570bp左右）之間有 1個多克隆位點（ multiple cloning sites， MCS）可供外源基因插入。 ③ 該區(qū)域（ MCS）插入了 1小段 ，有 β半乳糖苷酶基因（ LacZ）的調(diào)控序列及其 N端 146個 aa編碼信息，它與宿主菌（含 LacZ）α互補，形成有活性的 β半乳糖苷酶，使平板上底 Xgal生色成藍噬菌斑，當(dāng)外源基因插入 MCS，破壞了 α互補，幾乎無一例外生成無色（白）噬斑。這是一種非常有效的克隆篩選選擇性標志。 （ 2） M13mp18和 M13mp19是一對載體，它們有相同的 13個多克隆位點，但方向相反。（當(dāng) RF DNA被兩種限制酶切割后， M13mp18和M13mp19輕易不能重新環(huán)化，當(dāng)連接混合液中含外源匹配末端 dsDNA片段時方閉合成環(huán)，這一片段在二者中將以互為相反的兩個方向插入。這樣M13mp18正鏈中含有外源 DNA的一條鏈，而在 M13mp19正鏈中含外源DNA的另一條鏈）。所以 M13mp18和 M13mp19作為一對載體可用同一通用引物，（從所插入 DNA片段任一端開始），測定互為相反兩條鏈的 DNA序列。（并可制備只與外源 DNA任意 1條 DNA鏈互補的探針）。（分子克隆 P202）。 定向連續(xù)次級克隆待測大片段 DNA片段 測定數(shù) kb的 DNA序列時，可以建立一系列一端刪切 200300bp的DNA片段次級克隆。對它們分別測序，就可以連續(xù)讀出該大片段 DNA的全部序列。核酸酶 BAL31和核酸外切酶 III，均可以達到連續(xù)刪切的目的。 核酸酶 BAL31是從乳白短桿菌（ Brevibacterium albidum）細菌中分離。它能以漸進的方式將線型 DNA分子的 3’， 5’兩端同時降解，形成小的寡核苷酸片段或單核苷酸。底物可以是帶延伸末端的，也可以是平頭末端的 dsDNA，對 3’， 5’兩端降解有同樣性，此酶要求 Ca2+作輔因子，以 EDTA作螯合劑，可使該酶失活。 BAL31還有較弱的單鏈特異內(nèi)切酶活性，與核酸酶 S1相似，降解ssDNA或 ssRNA形成 5’磷酸末端的單或寡核苷酸酶片段，能從 DNA片段中切除單鏈尾巴，產(chǎn)生平頭末端。核酸酶 S1是從米曲霉（ Aspergillus Oryze）中分離的。 外切核酸酶 III是一種從 ，從 dsDNA的 3’OH末端降解產(chǎn)生 5’單核苷酸的外切酶。（此外，外核酸酶 III還有內(nèi)核酸酶，RnaseH和 3’磷酸酶的活性。 （三） DNA聚合酶 大腸桿菌 DNA聚合酶 I Klenow大片段 Klenow大片段 DDDPI是由分子量 109KD一條多肽鏈組成，此酶可被枯草桿菌蛋白酶分解成 2個片段， 1個片段分子量為 76KD，有聚合酶，3’→5’ 外切酶活力，此片段稱為 Klenow片段，另一片段 34KD，有 5’→ 外切酶活力。 此酶是末端終止法最早采用的酶，用它進行測序常常產(chǎn)生較高的本底和假帶，催化鏈延伸反應(yīng)的能力也較差，通常只能讀出距引物 250個核苷酸以內(nèi)的序列。此酶價格便宜，容易獲得，對于已知序列 DNA次級克隆的鑒定仍有應(yīng)用價值。 測序酶（ Sequenase） 測序酶是經(jīng)過改造的 T7噬菌體 DNA聚合酶，消除了 3’→5’ 外切酶活性。活性非常穩(wěn)定，具有很高的鏈延伸能力和極快的聚合反應(yīng)速度，是測定較長 DNA序列的首選酶。該酶及名稱是 HSB公司的專利。試劑盒已商品化。 TaqDNA聚合酶 Taq酶用于序列測定，除具有很好的鏈延伸性能外，還可以在高溫
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