dna操作技術(shù)ppt課件(編輯修改稿)
2025-06-01 12:09 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ? 有專一的識(shí)別順序，但不是對(duì)稱的回文順序 ,在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈。 限制性內(nèi)切酶的命名原則 命名原則： 取屬名的第一個(gè)字母大寫，取種名的前兩個(gè)字母小寫，構(gòu)成基本名稱。該種中發(fā)現(xiàn)的不同的酶按照順序編號(hào) I, II, III等。如存在變種和品系，取變種或品系的一個(gè)字母。若酶存在于質(zhì)粒上，則需大寫字母表示非染色體遺傳因子。 Pvu I識(shí)別 CGATCG， Pvu II識(shí)別 CAGCTG, 都來(lái)自于 Proteus vulgaris。 HindIII是在 Haemophilus influenzae d株中發(fā)現(xiàn)的第三種酶。 限制性內(nèi)切酶的命名原則 EcoRI表示基因位于 Escherichia coli中的抗藥性 R質(zhì)粒上。 許多內(nèi)切酶識(shí)別 6堿基序列，也有的識(shí)別 8核苷酸序列 Sau3A來(lái)自于Staphylococcus aureus 品系 3A，識(shí)別GATC。也有一些酶識(shí)別兼并序列，如HinfI來(lái)自于 Haemophilus influenzae品系 Rf，識(shí)別 GANTC， N代表 A, G, T, C。 限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物 鈍端（平端） 粘性末端 粘性末端；是交錯(cuò)切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。 垂直線表示中心對(duì)稱軸，從兩側(cè)“讀”核苷酸順序都是 GAATTC或 CTTAAG，這就是回文順序（ palindrome）。 _和‘表示在雙鏈上交錯(cuò)切割的位置，切割后生成 5’……G 和 AATTC……3’ 、3’……CTTAA 和 G……5’ 二個(gè) DNA片段，各有一個(gè)單鏈末端，二條單鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過(guò) DNA連接酶的作用而“粘合”。 II型酶切割方式的另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如 EcoRV 的識(shí)別位置是： 5’…… GAT’|ATC …… 3’ 3’…… CTA’|TAG …… 5’ 切割后形成 5’…… GAT 和 ATC …… 3’ 、 3’…… CTA 和 TAG …… 5’ 。這種末端同樣可以通過(guò) DNA連接酶連接起來(lái)。 限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物 同位酶（ Isoschizomers） :識(shí)別序列相同但切點(diǎn)不同的酶。 HpaII和 MspI都識(shí)別 5’??????GGCC??????3’，如其中有 5甲基胞嘧啶，則只有HpaII能切割。 同尾酶：識(shí)別位點(diǎn)不同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列。 限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物 同裂酶 （同切酶或異源同工酶） ：識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)均相同， 其差別只在于當(dāng)識(shí)別順序中有甲基化的核苷酸時(shí)，一種限制性內(nèi)切酶可以切割，另一種則不能。 HpaⅡ 和 MspⅠ 的識(shí)別順序都是5’??G’CG_G??3’ ，如果其中有 5’ 甲基胞嘧啶，則只有 HpaⅡ 能夠切割。 限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物 限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物 星號(hào)活力（第二活性） – PH –離子強(qiáng)度 –甘油濃度過(guò)高 ≥10%時(shí) –酶量 限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)會(huì)出現(xiàn)非專一性，因此應(yīng)確保酶的體積為總體積的十分之一以下 。 DNA分子中識(shí)別位點(diǎn)的數(shù)目 四堿基的酶平均大約每 256個(gè)核苷酸（ 44）有一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，而六堿基的酶大約 4096（ 46）個(gè)核苷酸有一個(gè)識(shí)別序列。 λ DNA長(zhǎng) 49kb，對(duì)于六堿基的酶應(yīng)該有 12個(gè)切割位點(diǎn)。如 Bgl II只有 6個(gè)， BamHI只有5個(gè)，而 SalI只有 2個(gè)，意味著 λDNA中 GC含量少于 50%。 這種方法只能粗略的估計(jì)，只有實(shí)
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