dna序列分析ppt課件(編輯修改稿)
2025-03-20 16:21 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 環(huán)境 中， DMS 主要作用于鳥嘌呤 G ，使之甲基化，導致糖苷鍵斷裂。 ? 哌啶甲酸 :可以使 DNA 鏈上的嘌呤在酸的作用下發(fā)生糖苷水解，導致 DNA 鏈在脫嘌呤位點（ G和 A）發(fā)生斷裂。 ?肼 :又稱聯(lián)氨 ，在堿性環(huán)境中作用于胞嘧啶 C 和胸腺嘧啶 T 的 C4 和 C6 位置，導致糖苷鍵斷裂。 ?肼 +高濃度的鹽 （ NaCl）：肼則主要作用于胞嘧啶 C ，使之斷裂。 ?作為標記用的放射性同位素主要有： γ32Ｐ（ [γ32Ｐ ]ATP， [γ32Ｐ ]GTP. [γ32Ｐ ]TTP ，或 [γ32Ｐ ]CTP），或 γ33NTP ， S35NTP 。 四、 化學降解法測序的應(yīng)用 ? MaxamGilbert 化學降解測序法不需要進行酶催化反應(yīng)，因此不會產(chǎn)生由于酶催化反應(yīng)而帶來的誤差； ?對未經(jīng)克隆的 DNA 片段可以直接測序； ?化學降解測序法特別適用于 測定含有如 5甲基腺嘌呤 A 或者 G ， C 含量較高的 DNA 片段，以及短鏈的寡核苷酸片段的序列。 ? 化學降解測序法既可以標記 539。末端，也可以標記 339。末端。如果從兩端分別測定同一條 DNA 鏈的核苷酸序列，相互參照測定結(jié)果，可以得到準確的 DNA 鏈序列。 第二節(jié) Sanger 雙脫氧鏈終止法法 1977年英國的 DNA復制的生物學特性，設(shè)計了一種通過 DNA復制來識別 4種堿基的方法，即 雙脫氧鏈終止測序（ dideoxy chain termination），或稱 Sanger 酶學法 。 基本原理 雙脫氧鏈終止法的 測序基礎(chǔ) 是以 雙脫氧核苷三磷酸 為循環(huán)測序反應(yīng)的鏈終止劑。 雙脫氧核苷酸 (dideoxynucleoside triphosphate, 2‘ ,3‘ddNTP,N指 A、 T、 G或 C )分子的脫氧核糖的 339。 位置的 OH 缺失。當它與其他正常核苷酸混合在同一個擴增反應(yīng)體系中時，在 DNA 多聚酶的作用下，雖然它也能夠象正常核苷酸一樣參與 DNA 合成，以其 539。 位置的磷酸基，與上位脫氧核苷酸的 339。 位置的 OH 結(jié)合，但是，由于它自身 339。 位置 OH 的缺失，至使下位核苷酸的 539。 磷酸基無法與之結(jié)合。如圖 所示。 雙脫氧核苷酸 （ ddNTP） 分子的結(jié)構(gòu)及 DNA 鏈合成終止反應(yīng) DNA 合成反應(yīng)； 摻入到 DNA 合成反應(yīng)后導致反應(yīng)終止 P OH dNTP ddNTP P OH OH P P P P OH 末端合成終止法 (sanger法 )原理 5’ 3’ 5’ 3’ 引物 模板 DNA dNTP DNA聚合酶 ddATP ddTTP ddGTP ddCTP ? 基于雙脫氧核苷酸的這種特性， Sanger 于 1977 年建立了以雙脫氧鏈終止法為基礎(chǔ)來測定 DNA 序列的方法。 ?該方法以待測單鏈或雙鏈 DNA 為模板，使用能與 DNA 模板結(jié)合的一段寡核苷酸為引物，在 DNA 多聚酶的催化作用下合成新的 DNA 鏈。 ?正常情況下的 DNA 多聚酶催化反應(yīng)在其反應(yīng)體系中只含有四種脫氧核苷酸（ dATP、 dCTP、 dGTP和dTTP），合成與模板 DNA 互補的新鏈。 ?當這個反應(yīng)體系中加入了一種放射性同位素 32P 或 35S 標記的雙脫氧核苷酸（ *ddATP 或 *ddCTP 或 *dd
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