dna操作技術(shù)ppt課件-資料下載頁(yè)
2025-05-05 12:09本頁(yè)面
【正文】 Bgl II的識(shí)別序列 5’A|GATCT A|GATCT3’ TCTAG|A TCTAG|A AGATCC GGATCT TCTAGG CCTAGA EaeI的識(shí)別序列 PyGGCCPu (Py表示嘧啶， Pu表示嘌呤）EayI的識(shí)別序列 CGGCCG 連接后重組分子僅能為 EaeI識(shí)別。 平頭末端的連接 粘性末端 分子內(nèi)部連接，平頭末端 分子間的連接。 提高連接效率的方法： –加大酶用量（ 10倍） –加大平頭末端底物的濃度 –加入 10%PEG（ 8000），促進(jìn)分子間的有效作用 –加入單價(jià)陽(yáng)離子， 150200mM NaCl –提高反應(yīng)溫度 平頭連接同樣存在兩種極性 不同粘性末端的連接 突出 539。末端 – Klenow補(bǔ)平，或 S1核酸酶切平，然后平頭連接 突出 339。末端 – T4DNApol切平，然后平頭連接 突出末端不同 – Klenow補(bǔ)平，或 S1核酸酶切平 連接后，可能恢復(fù)限制性位點(diǎn)，甚至還可能產(chǎn)生新的位點(diǎn)。 XbaI與 HindIII（ XbaI恢復(fù)）， XbaI與 EcoRI（均保留）， BamHI與 Bgl II（產(chǎn)生 ClaI位點(diǎn)） 人工粘性末端的連接 539。突出的末端 –外源片段先用 Klenow補(bǔ)平；然后用 TdT補(bǔ)加 polyC；載體片段也用 Klenow補(bǔ)平，加 polyG，退火不經(jīng)連接即可轉(zhuǎn)化。目的是：不使酶切位點(diǎn)遭受破壞。 339。突出的末端 –外源片段先用 TdT加 polyG；載體片段加 polyC；然后退火；再用 Klenow補(bǔ)齊；連接 平頭末端 –可直接用 TdT補(bǔ)加末端，但以加 polyA/T為佳。這樣稍微加熱， AT區(qū)就會(huì)出現(xiàn)單鏈區(qū)域，然后用 S1核酸酶水解即可回收片段 粘端與平端的連接 linker : 人工合成的、含有限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列的、短的雙鏈 DNA片段。 – 連接的效率較高 – 酶切時(shí)可能破壞 DNA分子的完整。 adaptor：人工合成的、具有粘性末端寡聚核苷酸。 1. Linkers 如何將平末端分子變?yōu)檎承阅┒朔肿?? 注意問題 2. Adaptors The distinction between the 5’and 3’terminal of a polynucleotide The use of adaptors 粘性末端的更換 在 DNA片段上某一酶切口處換成另一種酶切口 –BamHI酶切片段用 Klenow補(bǔ)平，或用 S1酶切平；連接一段 linker或 Adaptor，使之產(chǎn)生 EcoRI粘性末端。這樣 BamHI切口就換成了 EcoRI切口 。 –由 AluI更換 EcoRI： AluI切開， T4DNApol切平，另一段 DNA EcoRI切開，Klenow補(bǔ)平，連接，原來含有 AluI的片段變成含有 EcoRI 重組率 重組率：含有外源 DNA片段的重組分子數(shù)與加入的載體分子數(shù)之比。較為理想的重組率為 2575% 提高重組率的方法： –連接反應(yīng)條件 外源片段：載體＝ 2:110:1（分子數(shù)），增加碰撞機(jī)會(huì)，減少自身環(huán)化。 –載體除磷 （磷酸酯酶 5’除磷）。 –TdT在 3’端增加人工粘性末端，防止載體自我環(huán)化 。 Next Chap
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