【正文】 romophenolMCATCTGACGCATGGTTAA(NEB)， T4ATCATGAGTCCTGCTCGG3180。B:PCR儀 (Oryza sativa3’3’………TAGGCCACCGAACGGI CCv 表 1GCmTACT在細(xì)胞分裂過程中依據(jù) DNA母鏈的甲基化在 DNA識別回文序列 GATC,(de novo圖 45’氮胞苷可以與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（ DMT）結(jié)合從而抑制其活性，在 DNA復(fù)制過程中抑制維持甲基化作用，使復(fù)制后的 DNA甲基化水平降低。NaCl， 2%CTAB。G)3180。reactionCEDTA)(1)Marker（未酶切的 λDNA）估計其濃度。接著 94℃變性 30秒， loading （注意：從放入水中到放入顯影液中，時間不應(yīng)超過 10秒。膠聚合 1小時以上才可以電泳。純化 DNA，輕輕上下顛倒 1015分鐘4℃ 3000rpm離心 1015分鐘1992)不同處理的葉片 1g液氮中研磨成粉轉(zhuǎn)入 50ml離心管加入等體積 DNA提取緩沖液 (A:B:C=1:1:，加 1%PVP于 B液 )%? 銀染固定 /終止液 I(5180。v bufferv 實驗材料? 水稻：日本晴 G…CCACCGAACGGII酶切 +接頭ATCCGG 不切割 不切割Msp還可以進(jìn)一步對差異條帶進(jìn)行切膠回收、克隆、測序，以便得知發(fā)生甲基化變化的胞嘧啶的具體位置。測序 在此位置兩條鏈的腺嘌呤 N6位置上同時甲基化，同時 SAM轉(zhuǎn)變?yōu)镾AH(S腺苷高半胱氨酸 )在 DMT(DNA甲基轉(zhuǎn)移酶）的作用下， CpG（ CNG,CCGG）位點胞嘧啶 C5被甲基化 DNA甲基化作用圖 1methylation)vDNMT3a， DNMT3b兩種胞嘧啶甲基化方式 DNA胞嘧啶甲基化檢測方法? 使用對胞嘧啶 5’甲基化狀態(tài)敏感的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切處理，然后檢測多態(tài)性：v甲基化敏感擴增多態(tài)性 GCmTATTGGTGGCTTGCCmGGACTAGG C(m)C…所需儀器v 離心機 分析天平 圖 6v bufferEcoRI+AN:buffer? 接頭： EcoRI用時，加入 3ml 取水稻 Nipponbare種子 10粒 X調(diào)整 DNA濃度，置於 20℃ 備用。水稻 MSAP限制性酶切、連接體系v PCR擴增? 預(yù)擴增：水稻 AFLP預(yù)擴增體系如右表 (預(yù)擴增引物 PCR引物部分)： 裝板buffer,PAGE膠銀染v預(yù)期實驗結(jié)果? 同一位置處不同樣品電泳條帶的不同，顯示此處胞嘧啶甲基化狀態(tài)不同。? 凝膠顯影，將染色后的膠板放入雙蒸水中 510秒，迅速取出并豎起控水，隨后把膠板放入預(yù)冷的一半顯影液中，充分搖動，當(dāng)出現(xiàn)第一批條帶后，倒入另一半顯影液，輕搖至條帶全部出現(xiàn)。灌膠時玻璃板傾斜 15度。（第十七天）10 x PCR reaction buffer dNTPs () EcoR I primer (5μ M) H/M primer (5μ M) Taq DNA polymerase (5U/μL ) PCR water DNA 模板（ 預(yù)擴 增稀 釋產(chǎn) 物） 2μLTotal volume 15μL表 410 x PCR reaction buffer dNTPs