【正文】 m，高 100mm的中性玻璃安瓿管，先用 2%鹽酸浸泡 8～ 10h，再經(jīng)自來水沖洗多次，用蒸餾水涮洗 2～ 3次，烘干；貼好菌號及日期的標(biāo)簽，管口塞好棉塞，滅菌備用。 (2)保護(hù)劑的選擇及制備 一些對熱敏感的保護(hù)劑如血清等用過濾除菌 ， 牛奶 、 葡萄糖及乳糖等要控制滅菌溫度 。 一般情況下 ， 多數(shù)菌種可以用脫乳為保護(hù)劑 。 ? (3)菌種準(zhǔn)備及分裝 菌種要求為生長良好的純種，菌齡以處于 穩(wěn)定期 為好，孢子是新鮮的。每支長好的斜面加2～ 3ml保護(hù)劑，用接種環(huán)將菌苔輕輕刮起 (注意勿刮起培養(yǎng)基 )，制成菌懸液。 液體培養(yǎng)的菌種，則需經(jīng)離心收集和用滅菌生理鹽水洗滌細(xì)胞，收集的菌體用保護(hù)劑懸浮制成菌懸液。 ? (4)預(yù)凍 分裝好的安瓿管需要進(jìn)行預(yù)凍 ， 即放在 30～ 40℃ 下凍結(jié) 20～ 60min，也可以用干冰和無水乙醇凍 5～10min。 ? (5)冷凍干燥 經(jīng)預(yù)凍的安瓿放入干燥箱中抽真空干燥。此時(shí)干燥箱溫度控制在 30℃ 以下，并盡快使真度達(dá)到 66Pa以下，可升溫以加速水分升華，升溫不宜過快，以免引起樣品融化。 干燥時(shí)間以樣品最終水分含量達(dá)到 1%～ 3%為準(zhǔn)。 凍干樣品呈酥塊工松散片狀 。 干燥完畢將安瓿管在真空下用火焰燒熔密封。 ? (6)保藏及凍干管的啟用 密封好的凍干管在 4℃ 或 18℃ 下保藏 。 需用凍干菌種時(shí) ， 取出安瓿管用酒精表面消毒 ， 用小砂輪在無菌條件下打開 ， 或?qū)碴稠敳吭诰凭珶艋鹧嫔献茻?， 迅速滴上冷的無菌水 ， 使管破裂 ， 然后用鑷子等輕輕敲碎管口 ， 加入 ～ 菌塊成為懸液 ， 用無菌滴管或接種環(huán)移至斜面或液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng) 。 ?（ 1)菌的質(zhì)量 保藏的菌種應(yīng)在營養(yǎng)豐富的最適條件下 ，使之進(jìn)入穩(wěn)定期 ， 稍老一些的菌體對環(huán)境抵抗力強(qiáng) 。 另處 ， 作為冷凍干燥的菌懸液細(xì)胞濃度要高 ， 如果保存的菌液細(xì)胞濃度不高 ，就會使以后傳種造成困難 ， 保存期也會受到影響 。 注意事項(xiàng)： ?(2)保護(hù)劑 一般情況下 ， 那些容易保存的菌種對保護(hù)劑的要求不很嚴(yán)格 ， 而不易保存的菌種對保護(hù)劑的要求卻很苛刻 。 如個(gè)別菌種在脫脂乳作保護(hù)劑的情況下死亡率高達(dá) %， 而采用葡聚糖等混和保護(hù)劑時(shí)死亡率大大減少 。 ?（ 3） 干燥速度 實(shí)驗(yàn)表明 ， 慢速干燥比快速干燥存活率高 ， 如青霉菌 6h干燥存活率為 %， 而 3h為59%。 ?（ 4） 空氣的影響 冷凍干燥后空氣對細(xì)菌細(xì)胞影響較大，可導(dǎo)致細(xì)胞損傷進(jìn)而死亡，故在凍干后應(yīng)立即在真空下融封，才有利于長期保存。 ?（ 5） 溫度的影響 可以在室溫下保存 ， 但許多微生物在4℃ 保存的存活率要比在室溫下高 1倍 。 ?（ 6） 含水量的影響 水分含量過高對菌存活不利，完全脫水也不利于保存，一般把干燥后的細(xì)胞含水量控制在 3%以下 (1%～ 3%)。 (7)復(fù)蘇培養(yǎng) ?打開安瓿管后加入無菌水使凍干菌融化 ， 融化速度慢比快速融化的成活率要高 。 ?菌種能否適宜凍干保存 ， 需經(jīng)過實(shí)驗(yàn)來證明 。 ?凍干保藏的效果因微生物種類而異 ， 一般是細(xì)菌＞放線菌＞真菌＞藻類 ， 而菌絲體不宜用此法保存 。 七、液氮超低溫保存 ? 本方法是近年推廣使用的一種菌種保存法。大多數(shù)微生物如病毒、噬菌體，立克氏體，各種細(xì)菌、放細(xì)菌、支原體，各種絲狀菌、酵母、藻類和原蟲，特別是一些無法用凍干保存的微生物，都可用此法長期保存。工業(yè)微生物高產(chǎn)菌種也逐步采用此法保存。 ? 液氮保存的原理是 微生物在 130℃ 以下溫度時(shí)，它的新陳代謝作用停止，化學(xué)反應(yīng)也消失，而液氮溫度可達(dá) 196℃ ，在這種情況下可以長期保存 。 ? 保護(hù)劑 與冷凍干燥保存一樣 ， 液氮保存菌種也需要有保護(hù)物質(zhì) ， 可以用 10%的甘油 ， 使用方便 、 效果好 ，但有些菌對甘油敏感 ， 效果不佳 ， 可選用其他保護(hù)劑 ， 常用的有 5%～ 10%(V/V)二甲基亞砜； 20%二甲亞砜加 1%蛋白胨；吐溫 80及 等 ， 糖類也可作為一種保護(hù)劑 ， 但濃度適當(dāng)加以控制 。 ? 操作程序 ?(1)安瓿管 160℃ 烘干 ， 加棉塞滅菌備用 。 ?(2)菌種準(zhǔn)備 在最適培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)得到健壯菌種 ， 制成懸浮液 ， 如為不產(chǎn)孢子的真菌 ，則采用斜面或液體振蕩培養(yǎng) ， 制成菌絲片段 。 將菌懸淮分裝至滅菌安瓿管中 ， 每管 ～ ，然后用火焰將安瓿熔封 。 ? （ 3)凍結(jié) 將熔封后的安瓿管放慢速凍結(jié)器上 ， 以每分鐘下降 1℃ 的速度冷凍 ， 當(dāng)安瓿管溫度下降至 35℃ 時(shí) ， 即可把安瓿管移入液氮內(nèi)作長期保藏 。 ? (4)菌種的復(fù)蘇培養(yǎng) 直至全部溶化為止 ， 當(dāng)溶化后即開啟安瓿移至培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng) ， 扣作時(shí)應(yīng)特別注意安全 ， 防止爆炸或凍傷 ， 不宜戴線手套 ， 要戴皮手套操作 。 第五節(jié)、菌種的提純與復(fù)壯 ?一、菌種的提純 ?二、通過寄主體進(jìn)行復(fù)壯 ?三、淘汰已衰退的個(gè)體 一、菌種的提純 ?即從已衰退的菌種中 ， 通過分離純化 ， 將尚未退化的個(gè)體分離出來 ， 以恢復(fù)和建立具有原來生產(chǎn)性狀的群體 ， 繼續(xù)供科研及生產(chǎn)使用 。 ? 菌種提純： ? 一是只要求達(dá)到菌落純化的水平 ， 通過稀釋平板法 、劃線法 、 表面涂血法等常規(guī)操作法 ， 該方法較為粗放 ， 適用于菌退化不太嚴(yán)重的情況 。 ? 另一類方法 ， 可達(dá)到 “ 細(xì)胞純 ” 的水平 ， 采用單胞分離法 ， 也可以二者結(jié)合 ， 先用前一種方法獲得較純的菌種后再采用單胞分離法進(jìn)一步純化 。 二、通過寄主體進(jìn)行復(fù)壯 ?對于寄生性微生物如蘇云金桿菌、白僵菌、多角體病毒等，由于長期使用，其毒力會下降，導(dǎo)致殺蟲效率降低待衰退現(xiàn)象。這時(shí)可以 用菌種卻感染菜青蟲幼蟲 等，然后從致死的蟲體上重新分離，經(jīng)過幾次重復(fù)感染與分離，就可以逐步恢復(fù)和提高毒力。 三、淘汰已衰退的個(gè)體 ?通過 物理 、 化學(xué)的方法處理菌體 (或孢子 )，使大部分死亡 (80%以上 )， 存活的菌多為生長健壯者 ， 可從中選出優(yōu)良菌種來 。 國內(nèi)外菌種保藏機(jī)構(gòu) ?菌種是一個(gè)國家的重要資源，世界各國對菌種的保藏都極為重視。世界上有 700多家菌菌種保藏機(jī)構(gòu)，其中國際知識產(chǎn)權(quán)組織承認(rèn)的法定的保藏機(jī)構(gòu)僅有 28家。 ? 普通微生物菌種保藏管理中心 （ CCGMC） ? 中科院微生物所，北京， ? 中科院武漢病毒研究所 ? 農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心 （ ACCC） ? 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，北京 （ ISF） ? 工業(yè)微生物菌種保藏管理中心 （ CICC） ? 中國食品發(fā)酵工業(yè)科學(xué)研究院，北京，（ IFFI） ? 醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心 （ CMCC） ? 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所，南京 ? 衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所，北京 ? 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所 ? 抗生素菌種保藏管理中心 （ CACC） ? 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)學(xué)院抗生素研究所，北京 ? 四川抗生素工業(yè)研究所，成都 ? 華北制藥廠抗生素研究所，石家莊 ? 獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心 （ CVCC） ? 農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品檢察所，北京 ?美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所（ ATCC） ?美國冷泉港研究所（ CSH） ?日本東京大學(xué)應(yīng)用微生物研究所（ IAM） ?日本東京科研化學(xué)有限公司（ KCC） ?日本大阪發(fā)酵研究所（ IFO） ?英國國立標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所（ NCTC） ?美國國立衛(wèi)生研究所（ NIH） ?美國農(nóng)業(yè)部北方開發(fā)利用研究部（ NRRL） 思考題 ?常見菌種保藏方法有哪些，各有什么特點(diǎn)？ ?菌種選育方法有哪些？ ?如何進(jìn)行菌種的提純與復(fù)壯？