【正文】 物的培養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行交替循環(huán)培養(yǎng)待分離的菌懸液，從而使組成酶變異株得到富集。? 當(dāng)接種到不含誘導(dǎo)物而含有其它可利用碳源的培養(yǎng)基中時(shí)，兩種類型菌株同樣能較好地生長，但在此環(huán)境中組成型突變株已能合成有關(guān)的水解酶，而誘導(dǎo)型菌株就不能合成。? 將它們轉(zhuǎn)接入含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中時(shí)，變異株能迅速利用誘導(dǎo)底物進(jìn)行生長繁殖，而誘導(dǎo)型出發(fā)菌株需經(jīng)歷一個(gè)誘導(dǎo)合成酶的階段，兩類菌株的生長就不同步，組成酶變異株所占的比例將逐漸增大。? 3)誘導(dǎo)抑制劑法：有些化合物能阻止某些誘導(dǎo)酶的合成，當(dāng)在誘導(dǎo)物和誘導(dǎo)抑制劑同時(shí)存在的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)待分離菌群時(shí)，誘導(dǎo)型菌株不能產(chǎn)生誘導(dǎo)酶，無法正常生長，只有組成型變異株能夠利用底物進(jìn)行生長繁殖。 第十節(jié) 工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù) ? 在生產(chǎn)發(fā)酵中，具有高產(chǎn)有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的某一期待代謝產(chǎn)物主能力的微生物菌種的保存和長期保藏，對(duì)于一成功的工業(yè)發(fā)酵過程極為重要。一、理想的菌種保藏方法應(yīng)具備的條件(1)經(jīng)長期保藏后菌種存活健在；(2)保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型，特別是不改變初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的高產(chǎn)能力。(3)菌種保藏的基本措施是低溫、干燥、真空。二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)(1)冷凍干燥或真空干燥保藏；(2)超低溫或在液氮中冷凍保藏； (3)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２兀?4)土壤或陶瓷珠等載體于燥保藏。冷凍保藏 ? 冷凍保藏為保藏微生物菌種的最簡單而有效的方法。? 通過冷凍，使微生物代謝活動(dòng)停止。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了獲得滿意的冷凍結(jié)果，通常應(yīng)在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護(hù)劑。冷凍保藏時(shí)溫度要求在 20℃ 以下，同時(shí)應(yīng)認(rèn)真掌握好冷凍速度和解凍速變。? 冷凍深藏的缺點(diǎn)之一是培養(yǎng)物運(yùn)輸較困難。冷凍保藏種類 一、普通冷凍保藏技術(shù) (20℃ )二、超低溫冷凍保藏技術(shù) (60一 80℃ )三、液氮冷凍保藏技術(shù) 普通冷凍保藏技術(shù) (20℃)? 將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細(xì)胞分接到試管或指管肉，然后貯藏于一冰箱的冷藏室中，或于溫度范圍在 5～ 20℃ 的普通冰箱 (20℃) 中。或者，將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴(yán)格封好，同上置于冰箱中保存。? 用此方法可以維持若干微生物的活力 1—2 年。? 應(yīng)注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏。? 保藏過程中應(yīng)注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應(yīng)嚴(yán)格密封。? 這一方法雖簡便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長期保藏。二、超低溫冷凍保藏技術(shù) (60一 80℃)? 要求長期保藏的微生物菌種，一般都要求在 60℃ 以下進(jìn)行保藏。? 在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是：? 1．離心收獲對(duì)數(shù)生長中期至后期的微生物細(xì)胞；? 2．用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞；? 3．加入等體積的 20％甘油或 10％二甲亞砜；? 4．混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于 70℃ 超低溫冰箱中保藏。? ? 如果待保藏菌種生長在斜面上，則可用含 10％甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在 12℃ ／ min。若干細(xì)菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏 5年而活力不受影響。三、液氮冷凍保藏技術(shù) (一 )冷凍保護(hù)劑在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護(hù)劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油 10％、二甲亞砜 5％。所使用的甘油 — 般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過濾滅菌。(二 )液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟 1．待冷凍保藏菌種懸液的制備 (1)從生長斜面制備菌懸液：每一斜面加入 5ml含10％甘油的營養(yǎng)液體培養(yǎng)；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌體細(xì)胞懸液； ～ lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶， (2)從浸沒培養(yǎng)物制備菌懸液： 在浸沒培養(yǎng)液中加入等體積 20%無菌甘油；輕輕振蕩混勻培養(yǎng)液，如果菌體絮凝較緊，則需先用玻璃珠打散； 氮冷藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口；將所有封好的安瓿置于 5℃ 冰箱中 3min，以使細(xì)胞和懸浮培養(yǎng)基之間達(dá)到平衡。 2．控速冷凍 ．(1)將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中，然后置于一較大的金屬容器中；(2)將此金屬容器置于控速冷凍機(jī)的冷凍室中；(3)以 12℃/min 的致冷速度降溫，直到溫度達(dá)到相對(duì)溫度之上幾度的細(xì)胞凍結(jié)點(diǎn) (通常為 30℃) ；(4)補(bǔ)加一定量的液氮至系統(tǒng)中，使細(xì)胞在凍結(jié)點(diǎn)時(shí)盡可能快地發(fā)生相變；(5)細(xì)胞凍結(jié)后，將致冷速度降為 1℃/min ，直到溫度達(dá) 50℃ ；(6)將安瓿迅速移入液氮罐中于液相 ()96℃) 或 氣相 (156℃) 中保存。 如果無控速冷凍機(jī)，則一般可將安瓿或液氮瓶置于一 70℃ 冰箱中冷凍 4h，然后迅速移入液氮罐中保存。(三 )復(fù)蘇 1．從液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；2．迅速將安瓿置于 3740℃ 水浴中，并輕輕搖動(dòng)以加速解；3．用巴氏吸管將安瓿中貯存培養(yǎng)物移接入含有2m1無菌液體培養(yǎng)基的試管中，用同一支吸管反復(fù)抽吸數(shù)次，然后取 (約 8滴 )轉(zhuǎn)接入瓊脂斜面上。凍干保藏 ? 冷凍干燥的基本方法：是通過在減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升華，使培養(yǎng)物干燥。 此法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一。? 冷凍干燥過程中必須使用冷凍保護(hù)劑，目前國內(nèi)常用脫脂乳和蔗糖，國外尚有運(yùn)用動(dòng)物血清等的。? 大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏 10年之久而不喪失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無需進(jìn)行冷凍保藏，便于運(yùn)輸。培養(yǎng)物的凍干過程(二 )操作步驟1．啟動(dòng)冷凍干燥器的致冷單元。當(dāng)冷凝器的溫度達(dá)到 40℃ 時(shí)啟動(dòng)真空泵，使真空度達(dá)到 ～。2．將冷凍槽置于歧管之下方。槽中裝入 2／ 3體積的異丙醇，然后插入溫度計(jì)及可調(diào)溫控儀降溫探頭．打開降溫探頭控制醇浴溫度在 40℃ ，這 — 過程約需 30min。3．每支斜面加入 2ml 20％的脫脂乳，然后用巴氏吸管將斜面上的菌苔吹打下制成孢子或菌體均懸液，最終菌株濃度一般要求在 106CFU／ m1．用細(xì)菌浸沒培養(yǎng)物來保藏時(shí)，加入 40％的脫脂乳，混合制成含106CFU／ ml的均懸液。4．取下安瓿上的棉塞，然后用 lml移液管分裝安瓿 (／瓿 )，重新塞好棉塞。5．輕輕振蕩安瓿，以使細(xì)胞重新懸浮。將安瓿與歧管相聯(lián)后迅速置于醇浴中，然后調(diào)節(jié)溫控裝置。使細(xì)胞懸液迅速凍結(jié)。6． 15min后，將歧管與真空泵相通。7．維持 40℃ 的醇浴溫度 90120min，然后調(diào)節(jié)溫控裝置。使醇浴溫度上升至 10℃ ，維持 2h。8．關(guān)掉可調(diào)溫控裝置的降溫探頭，讓醇浴溫度上升至室溫 (25℃) ．9．在冷凍干燥的最初 4h內(nèi)應(yīng)定期測真空度，在安瓿置于真空下后 1h內(nèi)，真空度必須達(dá)到 ，并于菌懸液接近干燥時(shí)逐漸降到 ～ 。10 ．在真空狀態(tài)下，讓安瓿保存在冷凍干燥機(jī) 中至少 16h以獲得完全干燥。11．干燥后，在 ～ ．12．在所有安瓿都封蓋好后，撤去真空。13．關(guān)閉真空泵。14．關(guān)閉冷凝器。(三 )凍干菌種的保藏與再生1．保藏：冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于 5℃ 下保藏。較低的保藏溫度 (20～ 70℃) 對(duì)于培養(yǎng)物的長期穩(wěn)定更好。2．復(fù)蘇：(1)在超凈工作臺(tái)中用 70％酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂輪在安瓿中銼一道溝。(2)用無菌紗布或無菌毛巾包好安瓿，然后用手掰開安瓿．(3)在安瓿中加入 ～ 1ml營養(yǎng)液體培養(yǎng)基，慢慢旋轉(zhuǎn)安瓿，使凍干菌種復(fù)水。然后將此轉(zhuǎn)接到一含有再生培養(yǎng)基的無菌試管中，或直接接種瓊脂斜面或涂布平板。(4)在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀，可以將此直接振落入盛有 l～ 2ml液體培養(yǎng)基的試管中，輕輕振蕩 5～ l0min，然后用此懸液接種適宜的再生培養(yǎng)基。 其他保藏方法一、傳代保藏 二、礦物油中浸沒保藏 一、傳代保藏? 將菌種定期在新鮮瓊脂培養(yǎng)基上傳代，然后在一定的生長溫度下生長和保存的傳代保藏方法。? 可用于實(shí)驗(yàn)室中若干菌種的保藏。? 此法最為簡單和經(jīng)濟(jì)，且不要求任何特殊的設(shè)備。? 但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變。? 因此要求在基本培養(yǎng)基上傳代為好，目的是能淘汰突變株；同時(shí)轉(zhuǎn)接菌量應(yīng)保持較低水平。? 斜面培養(yǎng)物應(yīng)在密閉容器中于 5℃ 保藏，以防止培養(yǎng)基脫水并能降低代謝活性。? 此方法一般不適宜作工業(yè)生產(chǎn)菌種的長期保藏方法。二、礦物油中浸沒保藏? 將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫下保藏，此方法簡便有效。? 可用于絲狀真菌、酵母、細(xì)菌和放線菌的保藏。特別對(duì)難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔(dān)子菌等的保藏更為有效。? 浸沒保藏的操作要點(diǎn)是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長，然后注入經(jīng) 170℃ 下滅菌 12h的礦物油，礦物油的用量以高出培養(yǎng)物 1cm為宜。? 以液體石蠟作為保藏方法時(shí)，應(yīng)對(duì)需保藏的菌株預(yù)先作試驗(yàn)。因?yàn)槟承┚暝谝后w石蠟下生長還十分明顯，有些菌株如某些假絲酵母還會(huì)同化液體石蠟，也有的對(duì)液體石蠟保藏敏感。所有這些菌株都不能用液體石蠟保藏。為了預(yù)防不測，一般保藏株 2～ 3年也應(yīng)做一次存活試驗(yàn)。不同菌種保藏方法比較基因工程菌的保藏? 由載體質(zhì)粒等攜帶的外源 DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的、且很易丟失其外源質(zhì)粒復(fù)制子。質(zhì)?；蛲ǔ樗拗骷?xì)胞生長非必需。? 一般情況下當(dāng)細(xì)胞丟失這些質(zhì)粒時(shí)，生長速度會(huì)加快。? 當(dāng)培養(yǎng)基中加入抗生素時(shí)，抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞群體的極有用的生長選擇壓。而且在運(yùn)用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復(fù)制與染色體復(fù)制的協(xié)調(diào)。? 我們建議基因工程菌應(yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中。 微生物活力和穩(wěn)定性測定 ? 所有保藏菌種的方法都必須是長期可靠地保持菌種的優(yōu)良性狀不變。? 在保藏時(shí)定期檢測菌種活力，以確定保藏培養(yǎng)物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及確定在實(shí)際保藏過程中出現(xiàn)的細(xì)胞死亡程度和遺傳穩(wěn)定性。? 對(duì)工業(yè)微生物生產(chǎn)菌種來說，建議保藏菌種的形態(tài)學(xué)和生化特征 (如代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生、酶活力、遺傳特征及生化指標(biāo) )應(yīng)在保藏后加以檢測和確定。 ? 加速保藏試驗(yàn)可用于預(yù)測保藏過程中保藏培養(yǎng)物的穩(wěn)定性。在一給定溫度下通過對(duì)高溫下短期活力喪失程度檢測，可以用來預(yù)測嗜酸乳桿菌的穩(wěn)定性。? 成功的菌種長期保藏方法之有價(jià)值的指標(biāo)包括在保藏 6個(gè)月、 1年或更長時(shí)間后存活百分率 (或存活單位 )。細(xì)胞群體的形態(tài)學(xué)特征或一些特別的生化特征應(yīng)在菌種保藏前后保持同一性，以及實(shí)驗(yàn)室中、中試車間中和生產(chǎn)發(fā)酵中產(chǎn)品滴度的穩(wěn)定性，后者極為重要。演講完畢，謝謝觀看！