【正文】 將外源基因整合到宿主染色體上，雖然很穩(wěn)定，但通常僅有一個拷貝，不能高效表達(dá)。 ? 高度穩(wěn)定的高拷貝數(shù)質(zhì)?？墒雇庠椿蚋咝П磉_(dá)，但往往會引起細(xì)胞生長量的降低； ? 而單拷貝數(shù)的質(zhì)粒對細(xì)胞獲得最大生長量沒有影響，因此也有可能達(dá)到高效表達(dá)。 B、外源基因的表達(dá)效率 ? 外源基因在酵母中表達(dá)效率主要與啟動子、分泌信號和終止序列有關(guān)。 ? 分泌信號包括信號肽部分和前導(dǎo)肽部分的編碼序列，它幫助表達(dá)產(chǎn)物分泌出酵母細(xì)胞，并在分泌過程中被胞內(nèi)蛋白酶加工切割，產(chǎn)生正確的表達(dá)產(chǎn)物。 ? 表達(dá)產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外，既可避免對酵母細(xì)胞可能產(chǎn)生的不利影響，又可簡化純化步驟，不必破碎細(xì)胞，防止雜蛋白質(zhì)對分離造成的困難。 ? 由于酵母對表達(dá)蛋白的分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)和加工方式與高等真核生物相似，所以許多哺乳動物的蛋白質(zhì)都能在酵母中正確加工并分泌到胞外。 ? 酵母菌也能利用異源的分泌信號，但利用酵母菌自身的分泌信號一般較利用異源的分泌信號效率更高。 C、外源蛋白的糖基化 ? 與哺乳動物細(xì)胞相同，釀酒酵母也能使表達(dá)的外源蛋白在分泌過程中發(fā)生 N糖苷鍵和 O糖苷鍵連接的兩種糖基化。所分泌出來的異源蛋白糖基化產(chǎn)物與天然產(chǎn)物完全相同。 ? 酵母菌合成的外源蛋白經(jīng)氨基末端修飾、二硫鍵形成、蛋白質(zhì)折疊和糖基化后，可以分泌到培養(yǎng)基中，便于分離純化。 D、宿主菌株的影響 ? 酵母菌株及其生理狀況不同，明顯影響外源基因的表達(dá)。 ? 用于表達(dá)外源基因的酵母宿主菌株應(yīng)具備以下特點(diǎn) : 生長能力強(qiáng) 菌體內(nèi)源蛋白酶較弱 菌株性能穩(wěn)定 分泌能力強(qiáng) ? 外源基因表達(dá)產(chǎn)物容易受到酵母細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的分解，內(nèi)源蛋白酶活力低的菌株造成的破壞較小。常用的宿主菌株幾乎都是突變株，應(yīng)避免使用回復(fù)突變率高的不穩(wěn)定菌株。 基因工程菌的穩(wěn)定性 ? 基因工程菌在傳代中常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定現(xiàn)象。質(zhì)粒不穩(wěn)定可分為 分裂不穩(wěn)定 和 結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定 兩種情況。 ? 質(zhì)粒的分裂不穩(wěn)定是指基因工程菌分裂時，出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒的子代菌。 ? 質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定是指外源基因從質(zhì)粒上丟失、堿基重排或缺失，引起基因工程菌性能的改變。 ? 由于這類菌（指丟失了質(zhì)粒的工程菌）與帶有質(zhì)粒的菌相比有一定的生長優(yōu)勢，因此在培養(yǎng)中能逐漸代替帶有質(zhì)粒的菌成為優(yōu)勢菌，以致減少了外源基因的表達(dá)產(chǎn)量。 1）質(zhì)粒不穩(wěn)定的產(chǎn)生原因 ? 質(zhì)粒不穩(wěn)定常見的是分裂不穩(wěn)定，它主要與兩個因素有關(guān)： 一是含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率； 二是這兩種菌的比生長速率差異的大小。 ? 含低拷貝數(shù)的工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率較高，因此增加工程菌中的質(zhì)?？截悢?shù)有利于提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性； ? 含高拷貝數(shù)質(zhì)粒的工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率較低，但是大量外源質(zhì)粒的產(chǎn)生，造成含質(zhì)粒菌的比生長速率明顯低于不含質(zhì)粒菌，所以一旦產(chǎn)生了不含質(zhì)粒菌，能較快地取代質(zhì)粒菌成為優(yōu)勢菌，因此進(jìn)一步提高質(zhì)粒的拷貝數(shù)反而會增加含質(zhì)粒菌的生長負(fù)勢，影響質(zhì)粒的穩(wěn)定性。 ? 菌體生長對質(zhì)?？截悢?shù)有一定的影響，質(zhì)粒的拷貝數(shù)除與工程菌本身的特性有關(guān)外，還與培養(yǎng)條件有關(guān)。有報(bào)道，在高比生長速率時質(zhì)?？截悢?shù)下降，但質(zhì)粒穩(wěn)定性明顯增加。例如，表達(dá) β 半乳糖苷酶的工程菌 JM103在連續(xù)培養(yǎng)中，比生長速率從 ，質(zhì)?？截悢?shù)則從950降到 40. ? 但是在含高拷貝數(shù)質(zhì)粒的工程菌中，質(zhì)?？截悢?shù)的增加與產(chǎn)物的增加往往不成正比，這也許是含高拷貝數(shù)質(zhì)粒的菌中，蛋白質(zhì)的限速步驟是轉(zhuǎn)錄和翻譯，基因的大量復(fù)制加重了轉(zhuǎn)錄和翻譯的負(fù)擔(dān)，反而減慢了轉(zhuǎn)錄和翻譯的速度。 2）提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法 ? 工程菌的培養(yǎng)一般采用分成兩階段培養(yǎng)法來提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。 ? 在培養(yǎng)的第一階段以增加菌體的生長達(dá)到一定密度為目的，外源基因不表達(dá)，從而使工程菌與質(zhì)粒丟失菌的比生長速率的差別減少，增加了質(zhì)粒的穩(wěn)定性； ? 第二階段再誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)?？梢栽谂囵B(yǎng)基中加入選擇性壓力如抗生素等，以抑制質(zhì)粒丟失菌的生長。 ? 控制適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件也能使工程菌具有優(yōu)勢的比生長速率，可調(diào)控的培養(yǎng)條件有溫度、 pH、培養(yǎng)基組分和溶解氧等。 ? 有些含質(zhì)粒的菌對發(fā)酵環(huán)境改變的反應(yīng)比不含質(zhì)粒的菌要慢，通過間歇改變培養(yǎng)條件可以改變兩者的比生長速率，達(dá)到改善質(zhì)粒穩(wěn)定性的效果。 ? 如間歇供氧和改變稀釋速率都可以提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。在研究大腸桿菌表達(dá)干擾素 α a中，發(fā)現(xiàn)隨著稀釋度的增加，質(zhì)粒穩(wěn)定性明顯增加，干擾素的比效價明顯增大。 （六）工程菌的大規(guī)模培養(yǎng) ? 不同于傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝，工程菌發(fā)酵目的是希望能夠獲得大量的外源基因產(chǎn)物，盡可能減少宿主細(xì)胞本身蛋白的污染。 ? 外源基因的高水平表達(dá)，不僅涉及宿主、載體和克隆基因之間的相互關(guān)系，而且與其所處的環(huán)境條件息息相關(guān)。 ? 不同的發(fā)酵條件，工程菌的代謝途徑也許不一樣，對下游的純化工藝也會造成不同的影響。 ? 僅按傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝生產(chǎn)生物制品是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，需要對影響外源基因表達(dá)的因素進(jìn)行分析，探索出一套既始于外源基因高效表達(dá)，又有利于產(chǎn)品純化的發(fā)酵工藝。 培養(yǎng)基的影響 培養(yǎng)基的組成既要提高工程菌的比生長速率，又要保持重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性，使外源基因能夠高效表達(dá)。 1)碳源的影響 使用不同的碳源對菌體生長和外源基因表達(dá)有較大的影響。葡萄糖和甘油相比，它們所導(dǎo)致的菌體比生長速率及呼吸強(qiáng)度相差不大，但甘油的菌體得率較大，而葡萄糖所產(chǎn)生的副產(chǎn)物較多。 2)無機(jī)磷的影響 無機(jī)磷在許多初級代謝的酶促反應(yīng)中是一個效應(yīng)因子，如在 DNA、 RNA、蛋白質(zhì)的合成，糖代謝，細(xì)胞呼吸及 ATP水平的控制中，過量的無機(jī)磷會刺激葡萄糖的利用、菌體生長和氧消耗。 Ryan等研究無機(jī)磷濃度對重組大腸桿菌生長及克隆基因表達(dá)的結(jié)果表明，在低磷濃度下，盡管菌體濃度較低，但產(chǎn)物比產(chǎn)率及產(chǎn)物濃度都最高。 接種量的影響 接種量是指移入的種子液體積和培養(yǎng)液體積的比例，接種量的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期，它的大小取決于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵中的生長繁殖速度。 ? 接種量小，菌體延遲期較長，不利于外源基因的表達(dá)。 ? 接種量大，由于種子液中含有大量胞外水解酶，有利于對基質(zhì)的利用，可以縮短生長延遲期，并使生產(chǎn)菌能迅速占領(lǐng)整個培養(yǎng)環(huán)境，減少污染機(jī)會； ? 接種量過高往往會使菌體生長過快，代謝產(chǎn)物積累較多，反而會抑制后期菌體的生長。 溫度的影響 ? 溫度對基因表達(dá)的調(diào)控作用可發(fā)生在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯或低分子量的調(diào)節(jié)分子合成等水平上。在復(fù)制水平上可通過調(diào)控復(fù)制，來改變基因劑量，影響基因表達(dá)。 ? 溫度誘導(dǎo)的基因工程菌 ,其最佳的誘導(dǎo)溫度可能隨產(chǎn)物而異。溫敏擴(kuò)增型質(zhì)粒，升溫后質(zhì)?？截悢?shù)就處于失控狀態(tài)，對菌體生長有很大影響。對含此類質(zhì)粒的工程菌，通常要先在較低溫度下培養(yǎng)，然后升溫，以大量增加質(zhì)?？截悢?shù)，誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。 溶解氧的影響 ? 溶解氧是工程菌培養(yǎng)過程中影響菌體代謝的一個重要參數(shù)，溶解氧濃度對菌體生長和產(chǎn)物生成的影響很大。 ? 采用兩階段培養(yǎng)工藝，培養(yǎng)前期階段著重于優(yōu)化工程菌的最佳生長條件，培養(yǎng)后期階段著重于優(yōu)化外源蛋白的表達(dá)條件。 ? 控制適當(dāng)?shù)娜芙庋跻材苁构こ叹哂袃?yōu)勢的比生長速率。例如間歇供氧和改變稀釋速率都可以提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。從理論上說，外源基因表達(dá)的產(chǎn)量會更高。 pH的影響 ? 采用兩階段培養(yǎng)工藝，培養(yǎng)前期階段著重于優(yōu)化工程菌的最佳生長條件，培養(yǎng)后期階段著重于優(yōu)化外源蛋白的表達(dá)條件。 ? 采用自動調(diào)節(jié)程序，就可避免環(huán)境 pH激烈變化對細(xì)胞生長和代謝造成的不利影響。 ? 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞生長期的最佳 pH范圍在 ，而外源蛋白表達(dá)的最佳 pH為 ，因此發(fā)酵前期， pH可以控制在 ；當(dāng)開始熱誘導(dǎo)表達(dá)時，關(guān)閉堿泵，由于細(xì)胞自身代謝的結(jié)果， pH逐漸下降，這時有利于外源蛋白表達(dá)；當(dāng) pH降至 ，重新啟動堿泵，使 pH維持在，促使代謝盡可能朝有利于外源蛋白高度表達(dá)的方向發(fā)展。 總 結(jié) ? 必須建立工程菌發(fā)酵的最佳化工藝。最佳化工藝是指最短周期、最高產(chǎn)量、最好質(zhì)量、最低消耗、最大安全性、最周全的廢物處理效果與最低失敗率等綜合指標(biāo)。 ? 工藝最佳化需對不同的菌種做大量試驗(yàn)，取得重復(fù)性好的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)后，模擬發(fā)酵代謝曲線，預(yù)測放大值。只有對菌種生物特性和發(fā)酵工藝了如指掌，最佳工藝條件設(shè)計(jì)才更合理。 練 習(xí) ? 1 簡述自然選育的特點(diǎn)及方法，在生產(chǎn)實(shí)踐中為什么要進(jìn)行自然選育？ ? 2 敘述誘變育種的意義。闡述誘變育種方法學(xué)上包括哪兩部分？為了達(dá)到對菌種的高效率的誘變在操作時要注意哪些方面。 ? 3 敘述工業(yè)微生物雜交育種的意義，并以釀酒酵母為例說明有性雜交育種的步驟以及在發(fā)酵生產(chǎn)上有哪些應(yīng)用。 ? 4 敘述細(xì)胞原生質(zhì)體融合技術(shù)在育種上的意義及其操作步驟。論述該技術(shù)在工業(yè)發(fā)酵上有哪些優(yōu)越性及其應(yīng)用前景。 ? 5 何謂基因克?。ɑ蚬こ碳夹g(shù)）？簡述基因工程技術(shù)的基本操作步驟。論述利用基因克隆技術(shù)生產(chǎn)重組基因產(chǎn)物（例如生理活性物質(zhì)作為藥物或某些疫苗生產(chǎn)等）從根本上解決了傳統(tǒng)制藥生產(chǎn)上述產(chǎn)物的哪些難題？ ? 6 論述優(yōu)良載體應(yīng)具備哪些條件（特點(diǎn)）？在遺傳工程上常見的載體類型有哪些？ ? 7 在基因操作應(yīng)用上與真核細(xì)胞相比，原核表達(dá)系統(tǒng)具有哪些普遍的表達(dá)特色？據(jù)你所學(xué)的知識，論述以 ？就 （提示：針對胞外分泌的缺陷設(shè)計(jì)） ? 8 作為基因表達(dá)系統(tǒng)，酵母菌有哪些優(yōu)勢 /特色？（為什么酵母菌被認(rèn)為是表達(dá)外源蛋白，特別是真核蛋白的最適合的表達(dá)系統(tǒng)？） ? 9 論述外源基因在 。 ? 10 論述外源基因在釀酒酵母中表達(dá)的影響因素。 ? 11 基因工程菌常出現(xiàn)哪幾種質(zhì)粒不穩(wěn)定現(xiàn)象？敘述其產(chǎn)生原因，它會給發(fā)酵生產(chǎn)帶來何種危害？簡述提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法。 ? 12 論述基因工程菌大規(guī)模生產(chǎn)的影響因素。 Thank you for your attention