【正文】 ）和非理性的體外定向進(jìn)化（隨機(jī)化突變、定向篩選） 定點(diǎn)突變技術(shù) ? 定點(diǎn)突變技術(shù)是基于蛋白質(zhì)工程的理論，以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)新蛋白質(zhì)的氨基酸序列，應(yīng)用重組 DNA技術(shù)設(shè)計(jì)并構(gòu)建具有新性質(zhì)的蛋白質(zhì)或酶的過(guò)程。 ? 改變蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu) ? 普遍用于菌種改良 定向進(jìn)化技術(shù) ? 體外模擬自然進(jìn)化過(guò)程，使基因發(fā)生大量變異并定向選擇出所需性質(zhì)和功能的蛋白質(zhì)。 ? 特點(diǎn)：依賴基因隨機(jī)突變，建立突變體文庫(kù) ? 方法：易錯(cuò) PCR； DNA隨機(jī)重組（圖 28） 代謝工程的定義 ? 利用多基因重組技術(shù)有目的地對(duì)細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行修飾、改造，改變細(xì)胞特性，并與細(xì)胞基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合，為實(shí)現(xiàn)構(gòu)建新的代謝途徑，生產(chǎn)特定目的產(chǎn)物而發(fā)展起來(lái)的一個(gè)新的學(xué)科領(lǐng)域。 ? 又稱作途徑工程，是多基因的基因工程。 代謝工程育種思路 1. 改變代謝流： 改變分支代謝途徑的流向，阻斷有害代謝產(chǎn)物的合成。 （ 1）加速限速反應(yīng) （ 2）改變分支代謝途徑流向： 提高代謝分支點(diǎn)的某一分支代謝途徑酶系的活力，在與另外的分支代謝途徑的競(jìng)爭(zhēng)中占有優(yōu)勢(shì)，可以提高目的代謝末端產(chǎn)物的產(chǎn)量。 （ 3）構(gòu)建代謝旁路 （ 4）改變能量代謝途徑 2. 擴(kuò)展代謝途徑 （ 1） 在引入外源基因后 ， 使原來(lái)的代謝途徑向后延伸 ， 產(chǎn)生新的末端代謝產(chǎn)物 。 （ 2） 使原來(lái)的代謝途徑向前延伸 ， 可以利用新的原料生物合成代謝末端產(chǎn)物 。 3. 轉(zhuǎn)移或構(gòu)建新的代謝途徑 1)轉(zhuǎn)移代謝途徑 : 為生產(chǎn)某一新的化學(xué)結(jié)構(gòu)的代謝產(chǎn)物 ， 將催化某一代謝途徑的基因組克隆到另一不具備該種能力的微生物中 ， 達(dá)到代謝途徑轉(zhuǎn)移的目的 ， 使之具備生產(chǎn)該種新化合物的能力 。 2)構(gòu)建新的代謝途徑 : 利用基因工程手段 ， 通過(guò)克隆少數(shù)基因?qū)⒃瓉?lái)細(xì)胞中無(wú)關(guān)的兩條代謝途徑橋連在一起 ， 形成新的代謝途徑 。 組合生物合成育種 ? 通過(guò)合成化合物庫(kù)進(jìn)行高效率的篩選。 ? 一次性同步合成成千上萬(wàn)結(jié)構(gòu)不同的分子即組合庫(kù)，然后進(jìn)行生物活性測(cè)定和化合物結(jié)構(gòu)鑒定。（圖 29） 反向生物工程育種 ? 反向代謝工程針對(duì)限制生物活性的主要因素，在相關(guān)生物種類識(shí)別希望的表型，確定該表型的決定基因，通過(guò)重組 DNA技術(shù)將該基因在需改造的生物中克隆表達(dá)出來(lái)。 ? 策略：圖 210 ? 關(guān)鍵：確定希望表型的遺傳基礎(chǔ)。 第四節(jié) 發(fā)酵工業(yè)菌種保藏 工業(yè)生產(chǎn)菌種的退化現(xiàn)象及原因 菌種退化 （ degeneration） 主要指生產(chǎn)菌種或選育過(guò)程中篩選出來(lái)的優(yōu)良菌株 ， 由于連續(xù)傳代或保藏之后 ， 群體中某些生理和形態(tài)特征逐漸退化或完全喪失 （ 包括菌株產(chǎn)孢子能力 、發(fā)酵主產(chǎn)物產(chǎn)量下降 ） 的現(xiàn)象 。 退化的表現(xiàn) ?菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變：如蘇云金芽孢桿菌的芽孢和伴孢晶體變得小而少； ?生長(zhǎng)速度緩慢 ， 產(chǎn)孢子越來(lái)越少：如細(xì)黃鏈霉菌的菌苔變薄 、 生長(zhǎng)緩慢 ， 不再產(chǎn)生典型而豐富的橘紅色分生孢子層； ? 抗不良環(huán)境條件 （ 抗噬菌體 、 抗低溫等 ） 能力的減弱 。 ? 代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力下降：如藤倉(cāng)赤霉產(chǎn)赤霉素能力下降； 退化的原因 1）基因突變 那些控制生產(chǎn)性狀的基因發(fā)生負(fù)突變。 2）連續(xù)傳代 菌種退化的防治 1） 從菌種選育方面考慮 ?在育種過(guò)程中 ， 應(yīng)盡可能使用孢子或單核菌株 ，避免對(duì)多核細(xì)胞進(jìn)行處理； ?在使單鏈突變的同時(shí) ， 使另一條單鏈喪失模板作用 ， 以減少出現(xiàn)分離回復(fù)現(xiàn)象； ?誘變處理后應(yīng)進(jìn)行充分的后培養(yǎng)及分離純化，以保證菌株的 “ 純度 ” 。 2） 控制傳代次數(shù) 如產(chǎn)腺苷的芽孢桿菌黃嘌呤營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，回復(fù)子的比例隨傳代次數(shù)的增加而增加，腺苷產(chǎn)量也隨之下降。 3）創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件 在進(jìn)行棲土曲霉培養(yǎng)時(shí)，溫度從 2830℃ 提高到 3334℃ ，可防止產(chǎn)孢子能力的衰退。 4）利用不易衰退的細(xì)胞傳代 在放線菌和霉菌中，由于其菌絲細(xì)胞常含有幾個(gè)細(xì)胞核，若用菌絲接種就易出現(xiàn)衰退，而孢子一般是單核的，用于接種，就不會(huì)發(fā)生這類現(xiàn)象。有些霉菌如用其分生孢子傳代易于衰退，而改用其子囊孢子接種，則能避免退化。 5）采用有效的菌種保藏方法 純種分離法 在衰退菌種的細(xì)胞群中，一般還存在仍保持原有性狀的個(gè)體，設(shè)法對(duì)其進(jìn)行分離純化。 （二）、工業(yè)生產(chǎn)菌種的復(fù)壯 淘汰已衰退的個(gè)體 采用高溫或低溫及其方法淘汰衰退的個(gè)體。 選擇合適的培養(yǎng)條件 如平菇菌種在 PDA培養(yǎng)基上連續(xù)傳代會(huì)導(dǎo)致菌種衰退，而在 PDA綜合培養(yǎng)基（ PDA中添加維生素和蛋白胨等）中培養(yǎng)則能使衰退的菌種復(fù)壯。 （三）工業(yè)生產(chǎn)菌種的保藏 ?菌種保藏的意義： 保持菌種優(yōu)良性狀的穩(wěn)定 ， 滿足生產(chǎn)需要 。 ?菌種保藏的基本原理： 根據(jù)微生物的生理生化特性，人為地創(chuàng)造條件，使微生物處于代謝不活潑、生長(zhǎng)繁殖受到抑制的休眠狀態(tài)，以減少菌種的變異。一般可通過(guò)降低培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)成分、低溫、干燥和缺氧等方法，達(dá)到防止突變、保持純種的目的。 2．穿刺保藏法：常用于保藏各種需氣性細(xì)菌。 1．斜面保藏法 這是一種最基本的方法，適用范圍廣，細(xì)菌、真菌和放線菌都可應(yīng)用。 3．沙土管干燥保藏法： 這種方法適用于形成芽孢的細(xì)菌、形成孢子的絲狀真菌和放線菌。其原理是將微生物吸附在各種載體上，干燥后保藏。 4．冷凍干燥保藏法： 其基本原理是將微生物或孢子冷凍，然后在減壓的情況下使水分升華，使細(xì)胞的代謝、生理等生命活動(dòng)處在停止?fàn)顟B(tài)下長(zhǎng)期保藏。 5．液氮保藏法：其方法是將濃的懸液加入滅菌后的分散劑中，細(xì)菌加入最終濃度為 10%的甘油或5%二甲基亞砜（ DMSO）作為防凍的保護(hù)劑。 6．低溫保藏法：大多數(shù)微生物可在 20℃ 以下的低溫中保藏。使用密封性能好的螺旋口小管，加入 1— 2mL的菌液，直接放入低溫冰箱中保藏。 （四）、國(guó)內(nèi)外菌種保藏機(jī)構(gòu) 我國(guó)的主要微生物菌種保藏機(jī)構(gòu) 1） 普通微生物菌種保藏管理中心 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 、 中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所 2） 農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心 中國(guó)農(nóng)科院土壤肥料研究所 3）工業(yè)微生物菌種保藏管理中心 食品發(fā)酵工業(yè)科學(xué)研究院 4） 醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚研究所 、 衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所 、 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所 5） 抗生素菌種保藏管理中心 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院抗生素研究所 、 四川抗生素工業(yè)研究院 、 華北藥廠抗生素研究所 6）獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心 農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 國(guó)外主要的微生物菌種保藏機(jī)構(gòu) 1） 美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所 ATCC 2） 美國(guó)冷泉港研究室 CSH 3） 日本東京大學(xué)應(yīng)用微生物研究所 IAM 4）日本大阪發(fā)酵研究所 IFO 5） 日本東京科研化學(xué)有限公司 KCC 6） 英國(guó)國(guó)立標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所 NCTC 7） 美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所 NIH 8） 美國(guó)農(nóng)業(yè)部北方開發(fā)利用研究部 NRRL