【正文】 ion) 三、 DNA重組技術(shù)（分子育種） ? 利用基因工程能夠使 跨種 生物的 DNA插入到某一細(xì)胞質(zhì)復(fù)制因子中，進(jìn)而引入寄主細(xì)胞進(jìn)行成功表達(dá)。 ? （一） DNA重組過程 獲得目的基因 選擇基因載體 體外重組 外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞（細(xì)菌 、 植物 、 動物 ） 篩選和鑒定 應(yīng)用 常用載體 原核受體細(xì)胞： 質(zhì)粒、 λ 噬菌體 真核細(xì)胞受體： SV40病毒（動物）、 Ti質(zhì)粒（植物） 限制性內(nèi)切核酸酶 重組 DNA技術(shù)一般包括步驟 （ 1）制備供體 DNA （ 2）制備載體 DNA （ 3）連接 載體和供體 DNA片斷 （ 4）將受體菌制成原生質(zhì)體 （ 5）轉(zhuǎn)化作用 （ 6）再生和選擇 第四節(jié) 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng) ? 一、種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù) ? 二、種子制備的過程 ? 三、種子質(zhì)量控制 一、 種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù) ? 將保存在砂土管或冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面 活化 后，再經(jīng)過搖瓶 及 種子罐逐級擴(kuò)大培養(yǎng) ，從而 獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種 。 二、種子制備的過程 ? 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)一般包括： ? 斜面菌種的培養(yǎng) ? 搖瓶或茄子瓶培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)室種子制備階段 ? 一級種子的培養(yǎng) ? 二級種子的培養(yǎng) 生產(chǎn)車間種子制備階段 ? 發(fā)酵罐培養(yǎng) (1)放線菌孢子制備 : 采用斜面，培養(yǎng)基中含有一些 適合產(chǎn)孢子 的成分， 如： 麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機(jī)鹽等。 碳源和氮源不要太豐富 (碳源約為 1%，氮源不超過 %)。 碳源豐富 容易造成生理酸性的營養(yǎng)環(huán)境， 不利于 放線菌孢子的形成； 氮源豐富 則有利于菌絲繁殖而 不利于孢子 形成。 放線菌孢子制備 ? 一般情況下， 干燥 和 限制營養(yǎng) 可直接或間接 誘導(dǎo) 孢子形成。 培養(yǎng)溫度一般為 28?C， 少數(shù)為 37?C 。 培養(yǎng)時間為 5~14天。 放線菌種子擴(kuò)大培養(yǎng)的過程 ? 菌種 母斜面（孢子） 子斜面（孢子） 搖瓶種子（菌絲） 種子罐 發(fā)酵罐 （ 2）霉菌孢子的制備 ?一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。其營養(yǎng)成分 適合霉菌孢子的繁殖 。 ?培養(yǎng)溫度一般為 25~28℃ ?培養(yǎng)一般為 4~14天。 （ 3）細(xì)菌培養(yǎng)物的制備 ? 斜面培養(yǎng)基多采用 碳源限量 而 氮源豐富 的配方，牛肉膏、蛋白胨常用做有機(jī)氮源。培養(yǎng)溫度一般為： 37℃ ， ? 培養(yǎng)時間一般為 1~2天， ? 產(chǎn)芽孢的細(xì)菌則需培養(yǎng) 5~15天。 （ 1）搖瓶種子制備 （ 2）種子罐種子制備 兩步法： 微生物 生長 與 產(chǎn)酶 條件相差很大。 菌體先在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上大量繁殖，收集菌體濃 縮物，洗滌后再轉(zhuǎn)入添加 誘導(dǎo)物 的產(chǎn)酶培養(yǎng)基。 三、種子質(zhì)量的控制 影響孢子質(zhì)量的因素 影響種子質(zhì)量的因素 培養(yǎng)基 孢子質(zhì)量 溫度 、濕度 培養(yǎng)基 培養(yǎng)時間 培養(yǎng)條件 冷藏時間 種齡 接種量 接種量 例： 龜裂鏈霉菌斜面最適溫度為 ～ 37 ℃ ，如果 高于 37 ℃ ，則孢子 成熟早 ， 易老化 ，接入發(fā)酵罐后，就會出現(xiàn) 菌絲對糖、氮利用緩慢， 氨基氮回升提前， 發(fā)酵產(chǎn)量降低 等現(xiàn)象。培養(yǎng) 溫度控制低一些 ，則有利于孢子的形成。龜裂鏈霉菌斜面先放在 ℃ 培養(yǎng) 3天 ，再放在 ℃ 培養(yǎng) 1天 ，所得的孢子數(shù)量比在 ℃ 培養(yǎng) 4天所得的孢子數(shù)量增加 3～ 7倍。 b. 孢子培養(yǎng)時間 ? 如： 土霉素菌種斜面培養(yǎng) ，孢子尚未完全成熟，冷藏 7～ 8天菌絲即開始自溶。而培養(yǎng)時間延長半天 (即培養(yǎng) 5天 )，孢子完全成熟，可冷藏 20天也不自溶。 ? 過于衰老的孢子會導(dǎo)致生產(chǎn)能力下降 ，孢子的培養(yǎng)時間應(yīng)控制在孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量正常的階段終止培養(yǎng)。 c. 孢子的冷藏時間 ? 斜面孢子的冷藏時間，對孢子質(zhì)量也有影響，其影響隨菌種不同而異， 總的原則是冷藏時間宜短不宜長。 ? 有報道 : 在鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在 6 ℃ 冷藏 2個月后的發(fā)酵單位比冷藏 1個月的低 18％，冷藏 3個月后則降低 35％。 ? 一般一支高度為 20 cm、直徑為 3 cm的試管斜面，絲狀菌孢子數(shù)要求達(dá)到 107以上。 孢子質(zhì)量 培養(yǎng)基 培養(yǎng)條件 種齡 接種量 ? 影響因素： 溫度、 pH值、攪拌速度、通氣量等。 ? 發(fā)酵的目的是為了獲得盡可能多的發(fā)酵產(chǎn)物，其培養(yǎng)基一般比較濃，而種子培養(yǎng)基以略稀薄為宜。 a. 種齡 種齡 ——種子培養(yǎng)時間稱為種齡。 ? 在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，一般都選在生命力極為旺盛的對數(shù)生長期，菌體量 尚未達(dá)到最高峰時 移種。 ? 過于年輕的種子 接入發(fā)酵罐后，往往會出現(xiàn)前期生長緩慢、泡沫多、發(fā)酵周期延長 ? 而種齡過老的種子 接入發(fā)酵罐后，則會因菌體老化而導(dǎo)致生產(chǎn)能力衰退。 ? 在土霉素生產(chǎn)中，一級種子的種齡相差 2～ 3 h，轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐后，菌體的代謝就會有明顯的差異。 ? 最適種齡因菌種不同而有很大差異。一般需經(jīng)過多種實(shí)驗(yàn)來確定 細(xì)菌為 7~24h （谷氨酸生產(chǎn)菌為 7~8h） 霉菌為 15~50h 放線菌為 21~64h 嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿 性蛋白酶， 12小時 最好 b. 接種量 ? 通常接種量： ? 細(xì)菌 1~5%， ? 霉菌為 10%， ? 酵母菌 5~10%， ? 多數(shù)抗生素為 7%~15%，有的可加大到 20%~25%。 有關(guān)接種的幾種方法 ? 雙種法： 即 2個種子罐的種子接入 1個發(fā)酵罐。 ? 倒種法： 為防止種子染菌或種子質(zhì)量不理想，采 用以適宜的發(fā)酵液倒出部分對另一發(fā)酵 罐作為種子。 ? 混種法： 即以種子液和發(fā)酵液混合作為發(fā)酵罐的 種子。 ? 以上三種方法運(yùn)用得當(dāng)，有可能提高發(fā)酵產(chǎn)量，但其染菌機(jī)會和變異機(jī)會增多 。 （ 1） 形態(tài)： ? 單細(xì)胞 ：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)； ? 霉菌、放線菌 ：菌絲粗壯、對某些染料著色力強(qiáng)生長旺盛、菌絲分枝情況和內(nèi)含物情況好。 （ 2） 生化指標(biāo)： 種子液中糖、氮、磷含量及 pH的變化是菌體生長繁殖、物質(zhì)代謝的反映，不少產(chǎn)品的種子質(zhì)量以這些物質(zhì)的利用情況及變化為指標(biāo)。 （ 3） 產(chǎn)物生成量： 種子液中產(chǎn)物生成量的多少是種子生產(chǎn)能力和成熟程度的反映。 （ 4） 酶活力 ：如土霉素生產(chǎn)的種子液中的淀粉酶活力與發(fā)酵單位有一定的關(guān)系，可作為質(zhì)量依據(jù)。 （ 5） 無污染： 確保無任何雜菌污染。 ? （ 1）生長發(fā)育緩慢或過快 與孢子質(zhì)量或種子罐培養(yǎng)條件有關(guān)。生產(chǎn)中，通入種子罐的 無菌空氣的溫度較低 或者 培養(yǎng)基的滅菌質(zhì)量較差 是種子生長代 謝緩慢的主要原因。 ? （ 2）菌絲結(jié)團(tuán) 在液體培養(yǎng)條件下，菌絲聚集成團(tuán)（白色小顆 粒），影響氧及營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。原因和攪拌效果 差、 接種量小 有關(guān)。 ? （ 3）菌絲粘壁 種子培養(yǎng)過程中，由于 攪拌效果不好 或 泡沫過多 及 種子罐裝 液系數(shù)過小 等原因使菌絲逐步粘在罐壁上。其結(jié)果使培養(yǎng)液中 的菌絲減少，可能形成菌絲團(tuán)。 真菌 粘壁的機(jī)會較多。 ? 阿維拉霉素 （ avilamycin）是一種新型消化促進(jìn)劑，能夠明顯的促進(jìn)雞和豬的生長，提高飼料的利用率。但是，在發(fā)酵生產(chǎn)研究中發(fā)現(xiàn)菌絲結(jié)團(tuán)是影響阿維拉霉素生產(chǎn)的主要問題之一。 ? 通過試驗(yàn)： ? 當(dāng)接種量低于 3％時，菌體生長緩慢，出現(xiàn)菌絲結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，且菌體生物量及阿維拉霉素的產(chǎn)量低。接種量越低，結(jié)團(tuán)現(xiàn)象越明顯。 ? 但是，當(dāng)接種量大于 5％時，雖然發(fā)酵液比較粘稠，阿維拉霉素的產(chǎn)量開始上升。 ? 出現(xiàn)這一現(xiàn)象原因是： 較大的接種量，菌種進(jìn)入發(fā)酵培養(yǎng)基后容易適應(yīng)， 菌種液中含有大量體外水解酶類 ，有利于產(chǎn)生菌對原料的利用。 ? 作業(yè)： ? ？ ? ? ？