【正文】 ? 作業(yè)： ? ？ ? ? ？ 。 ? 但是，當(dāng)接種量大于 5％時(shí)，雖然發(fā)酵液比較粘稠，阿維拉霉素的產(chǎn)量開始上升。 ? 通過試驗(yàn)： ? 當(dāng)接種量低于 3％時(shí)，菌體生長(zhǎng)緩慢，出現(xiàn)菌絲結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，且菌體生物量及阿維拉霉素的產(chǎn)量低。 ? 阿維拉霉素 （ avilamycin）是一種新型消化促進(jìn)劑，能夠明顯的促進(jìn)雞和豬的生長(zhǎng)，提高飼料的利用率。其結(jié)果使培養(yǎng)液中 的菌絲減少，可能形成菌絲團(tuán)。原因和攪拌效果 差、 接種量小 有關(guān)。生產(chǎn)中，通入種子罐的 無菌空氣的溫度較低 或者 培養(yǎng)基的滅菌質(zhì)量較差 是種子生長(zhǎng)代 謝緩慢的主要原因。 （ 5） 無污染： 確保無任何雜菌污染。 （ 3） 產(chǎn)物生成量： 種子液中產(chǎn)物生成量的多少是種子生產(chǎn)能力和成熟程度的反映。 （ 1） 形態(tài)： ? 單細(xì)胞 ：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)； ? 霉菌、放線菌 ：菌絲粗壯、對(duì)某些染料著色力強(qiáng)生長(zhǎng)旺盛、菌絲分枝情況和內(nèi)含物情況好。 ? 混種法： 即以種子液和發(fā)酵液混合作為發(fā)酵罐的 種子。 有關(guān)接種的幾種方法 ? 雙種法： 即 2個(gè)種子罐的種子接入 1個(gè)發(fā)酵罐。 ? 最適種齡因菌種不同而有很大差異。 ? 過于年輕的種子 接入發(fā)酵罐后，往往會(huì)出現(xiàn)前期生長(zhǎng)緩慢、泡沫多、發(fā)酵周期延長(zhǎng) ? 而種齡過老的種子 接入發(fā)酵罐后，則會(huì)因菌體老化而導(dǎo)致生產(chǎn)能力衰退。 a. 種齡 種齡 ——種子培養(yǎng)時(shí)間稱為種齡。 孢子質(zhì)量 培養(yǎng)基 培養(yǎng)條件 種齡 接種量 ? 影響因素： 溫度、 pH值、攪拌速度、通氣量等。 ? 有報(bào)道 : 在鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在 6 ℃ 冷藏 2個(gè)月后的發(fā)酵單位比冷藏 1個(gè)月的低 18％，冷藏 3個(gè)月后則降低 35％。 ? 過于衰老的孢子會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)能力下降 ，孢子的培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)控制在孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量正常的階段終止培養(yǎng)。 b. 孢子培養(yǎng)時(shí)間 ? 如： 土霉素菌種斜面培養(yǎng) ，孢子尚未完全成熟，冷藏 7～ 8天菌絲即開始自溶。培養(yǎng) 溫度控制低一些 ，則有利于孢子的形成。 菌體先在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上大量繁殖，收集菌體濃 縮物，洗滌后再轉(zhuǎn)入添加 誘導(dǎo)物 的產(chǎn)酶培養(yǎng)基。培養(yǎng)溫度一般為： 37℃ ， ? 培養(yǎng)時(shí)間一般為 1~2天， ? 產(chǎn)芽孢的細(xì)菌則需培養(yǎng) 5~15天。 ?培養(yǎng)溫度一般為 25~28℃ ?培養(yǎng)一般為 4~14天。 放線菌種子擴(kuò)大培養(yǎng)的過程 ? 菌種 母斜面（孢子） 子斜面（孢子） 搖瓶種子（菌絲） 種子罐 發(fā)酵罐 （ 2）霉菌孢子的制備 ?一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。 培養(yǎng)溫度一般為 28?C， 少數(shù)為 37?C 。 碳源豐富 容易造成生理酸性的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境， 不利于 放線菌孢子的形成； 氮源豐富 則有利于菌絲繁殖而 不利于孢子 形成。 二、種子制備的過程 ? 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)一般包括： ? 斜面菌種的培養(yǎng) ? 搖瓶或茄子瓶培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)室種子制備階段 ? 一級(jí)種子的培養(yǎng) ? 二級(jí)種子的培養(yǎng) 生產(chǎn)車間種子制備階段 ? 發(fā)酵罐培養(yǎng) (1)放線菌孢子制備 : 采用斜面，培養(yǎng)基中含有一些 適合產(chǎn)孢子 的成分， 如： 麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機(jī)鹽等。 原生質(zhì)體融合(protoplast fusion) 三、 DNA重組技術(shù)（分子育種） ? 利用基因工程能夠使 跨種 生物的 DNA插入到某一細(xì)胞質(zhì)復(fù)制因子中，進(jìn)而引入寄主細(xì)胞進(jìn)行成功表達(dá)。 滅活原生質(zhì)體融合技術(shù) 單一親株滅活（ 滅活原養(yǎng)型再篩選原養(yǎng)型 ） 雙親株滅活 ? 例如 將鏈霉素產(chǎn)生菌 灰色鏈霉菌 的 ? 高產(chǎn)菌株 81 3 84102 ? 野生型菌株 、 ? 四個(gè)親株 的原生質(zhì)體 等量 混合后，均等分成兩份，分別用 熱 和 紫外線 滅活，然后進(jìn)行融合，獲得的融合子中有一株兼有生產(chǎn)菌株的 效價(jià)高 和野生型菌株的 生長(zhǎng)快 的雙重優(yōu)點(diǎn)。 ? 在各菌落中選擇融合子是很繁瑣的。 ? 滅活原生質(zhì)體融合法： 在融合中滅活 1個(gè)親株的原生質(zhì)體與另一親株的原生質(zhì)體融合，被滅活的親株可不加任何遺傳標(biāo)記，只需對(duì)活菌株進(jìn)行標(biāo)記，大大減少融合前親株進(jìn)行遺傳標(biāo)記的工作量。 ? 營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記選擇： 為常規(guī)而準(zhǔn)確的選擇手段。 ? 主要依靠在選擇培養(yǎng)基上的 遺傳標(biāo)記 。 ? 再生率常為百分之零點(diǎn)幾至百分之幾十。它具有生物活性，但不是正常的細(xì)胞， 在普通培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng) 。該法為一個(gè)空間、時(shí)間同步的可控過程，對(duì)細(xì)胞無毒害作用。 ? 電融合技術(shù)： 原生質(zhì)體在電場(chǎng)中極化成 偶極子 ，并沿電力線方向排列成串，然后加 直流脈沖 后，原生質(zhì)體 膜被擊穿 ，導(dǎo)致融合的發(fā)生。 PEG具有促進(jìn)原生質(zhì)體融合的作用。 ? 制備好的二親本原生質(zhì)體可通過 化學(xué)因子誘導(dǎo) 或 電場(chǎng)誘導(dǎo) 進(jìn)行融合。 ? 酵母菌和霉菌一般用 蝸牛酶 或 纖維素酶 。 ? 例如： 青霉菌的雜交過程 雜交育種的遺傳標(biāo)記 營(yíng)養(yǎng)缺陷型 —— 常用 抗性標(biāo)記 二、原生質(zhì)體融合育種 ? 用 脫壁酶 處理將微生物細(xì)胞壁除去，制成 原生質(zhì)體 ，再用聚乙二醇（ PEG）促進(jìn)原生質(zhì)體發(fā)生融合，從而獲得異核體 及 重組子 ，這一技術(shù)叫原生質(zhì)體融合。 該法克服了 誘變育種定向性差 的缺點(diǎn) 。但不能達(dá)到 定向育種 的目的。 并采用通氨補(bǔ)料 的工藝，使產(chǎn)量有了新的突破。 ? 菌種的發(fā)酵產(chǎn)量決定于 菌種的遺傳特性 菌種的培養(yǎng)條件 ? 突變株的遺傳特性改變了，其培養(yǎng)條件也應(yīng)該作出相應(yīng)的改變。 許多抗生素和氨基酸有共同的前體 或者有些氨基酸本身可以作為某些抗生素的前體。 因而可選出去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株。 利用葡萄糖的（毒性）結(jié)構(gòu)類似物篩選去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株 ? 例如， 以半乳糖作為可供菌生長(zhǎng)利用的惟一碳源，再于培養(yǎng)基中添加葡萄糖的結(jié)構(gòu)類似物，該結(jié)構(gòu)類似物不能為菌所利用，但可抑制菌利用半乳糖。 ? 例如， 將菌在含有葡萄糖 (阻遏性碳源 )和組氨酸為惟一氮源的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代后，可選出 去葡萄糖分解代謝調(diào)節(jié)突變株 。 ? 抗生素生產(chǎn)中最常見的碳源分解代謝調(diào)節(jié)是“葡萄糖效應(yīng)”，葡萄糖被快速分解代謝 所積累的分解代謝產(chǎn)物 在 抑制抗生素合成 的同時(shí) 也抑制其他某些碳、氮源的分解利用 。 協(xié)同反饋抑制，當(dāng)其中一產(chǎn)物單獨(dú)過量時(shí)則無抑制作用。 工作量大、時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜。 ③影印法 （ 3） 突變株的篩選 ? 育種工作中常采用 隨機(jī)篩選 和 理性化篩 選這兩種篩選方法。 營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株檢出 ? 檢出方法： ? 逐個(gè)測(cè)定法（點(diǎn)植對(duì)照法）、 ? 夾層平板法（延遲補(bǔ)給法）、 ? 限量營(yíng)養(yǎng)法、 ? 影印接種法等 。 3）差別殺菌法（芽孢菌） ? 利用芽孢桿菌類的芽孢和營(yíng)養(yǎng)體對(duì)熱敏感性的差異，讓誘變后的細(xì)菌形成芽孢，然后把處在芽孢階段的細(xì)菌移到基本培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)一定時(shí)間，野生型芽孢萌發(fā)，而營(yíng)養(yǎng)缺陷型芽孢不能萌發(fā)。然后稀釋、涂皿分離。 ? 把誘變處理后的孢子移入到基本培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng) 10h左右，使野生型孢子萌發(fā)的菌絲剛剛?cè)庋劭梢?，用滅菌的脫脂棉、濾紙或玻璃漏斗除去菌絲。 缺陷 型 的濃縮： ① 抗生素法 原理： 青霉素 、 制霉菌素等抗生素作用于生長(zhǎng)著的微生物細(xì)胞 ， 對(duì)休止態(tài)細(xì)胞無作用 。 淘汰野生型菌株 ? 目的： 富集營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株 ? 方法： 1 ）抗生素法 2 ）菌絲過濾法 3 ）差別殺菌法（芽孢菌） 4 ）饑餓法 1）抗生素法 細(xì)菌 ——青霉素法 (細(xì)胞壁為肽聚糖類，正常細(xì)菌敏感，營(yíng)養(yǎng)缺陷型處于休止?fàn)顟B(tài)不能生長(zhǎng)而被保留）。 各種化學(xué)誘變劑常用的濃度 處理時(shí)間 誘變劑 誘變劑的濃度 處理時(shí)間 緩沖液 終止反應(yīng)方法 亞硝酸 ０ .０１－０ .１mol/l ５－１０ min 酸緩沖液 ,酸二氫鈉 硫酸二乙酯（ DES） ０．５％－１％ １０－３０ min ,磷酸緩沖液 硫代硫酸鈉或大量稀釋 甲基硫酸乙酯（ EMS） ０．０５－０．５mol/l