【正文】 對其合成控制較弱，因此，改變環(huán)境條件易于影響其表達，基因型改變后的產(chǎn)量變異幅度也較大，而初級代用產(chǎn)物則與此相反。這在選擇提高代謝產(chǎn)物方法時應(yīng)予考慮。提高初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法主要有以下幾種： 1，使用誘導(dǎo)物 與糖類和蛋白質(zhì)降解有關(guān)的水解酶類大都屬誘導(dǎo)酶類，因此向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物就會增加胞外酶的產(chǎn)量。如加入槐糖(1，2—β—D—葡二糖)誘導(dǎo)木霉菌的纖維素酶的生成，木糖誘導(dǎo)半纖維素酶和葡萄糖異構(gòu)酶的生成等。但誘導(dǎo)物的價格往往比較貴，經(jīng)濟上未必合算。加入廉價的含有誘導(dǎo)物的原料，如槐豆英等某些種籽皮中含有槐糖，玉米芯富含木聚糖，培養(yǎng)過程中可陸續(xù)被水解產(chǎn)生槐糖、木糖，這都是經(jīng)常采用的方法。但是，玉米芯等這類不溶性聚合物的分解過程緩慢，以其為唯一碳源時，培養(yǎng)周期比較長，產(chǎn)品的體積生產(chǎn)率仍難大幅度提高?？煽紤]先使微生物在廉價的可溶性碳源中迅速生長，形成大量菌體后，再加入誘導(dǎo)物誘導(dǎo)水解酶類生成的方法。 誘導(dǎo)物的濃度過高及能被迅速利用時，也會發(fā)生酶合成的阻遏，這在纖維二糖對纖維素酶的產(chǎn)生，木二糖對半纖維素酶產(chǎn)生中都己觀察到，這也是使用誘導(dǎo)物時應(yīng)予注意的。 2，除去誘導(dǎo)物——選育組成型產(chǎn)生菌 在發(fā)酵工業(yè)中，要選擇到一種廉價、高效的誘導(dǎo)物是不容易的，分批限量加入誘導(dǎo)物在工藝上也多不便，更為有效的方法是改變菌株的遺傳特性，除去對誘導(dǎo)物的需要，即選育組成型突變株。通過誘變處理，使調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，不產(chǎn)生有活性的阻遏蛋白，或者操縱基因發(fā)生突變不再能與阻遏物相結(jié)合，都可達到此目的。迄今尚未見由于結(jié)構(gòu)基因發(fā)生改變而得到組成型的報道。 已設(shè)計出多種選育組成型突變株的方法，其主要原則是創(chuàng)造一種利于組成型菌株生長而不利于誘導(dǎo)型菌株生長的培養(yǎng)條件，造成對組成型的選擇優(yōu)勢以及適當(dāng)?shù)淖R別兩類菌落的方法，從而把產(chǎn)生的組成型突變株選擇出來。例如把大腸桿菌半乳糖苷酶的誘導(dǎo)型菌株經(jīng)誘變處理后，先在含乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，由于組成型突變株半乳糖苷酶的合成不需誘導(dǎo)即能產(chǎn)生，因此可較誘導(dǎo)型的出發(fā)菌株較早開始生長，在一定時期內(nèi)菌數(shù)的增加便較快，如持續(xù)進行培養(yǎng)時，由于誘導(dǎo)酶形成后，原菌株生長速率亦逐漸增加，這種選擇性造成的差別就會減少，可用交替在乳糖、葡萄糖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的方法。兩者利用葡萄糖時的生長速率是相同的，乳糖為碳源造成的組成型菌株的優(yōu)勢生長會持續(xù)下去，最后由平板分離就易于得到組成型突變株。以乳糖為限制性生長因子進行連續(xù)培養(yǎng)時，生長速率較低的誘導(dǎo)型菌株就會被沖洗掉，也是利用了上述原理。誘導(dǎo)型菌株不經(jīng)誘變處理，利用其自發(fā)突變，用連續(xù)培養(yǎng)方法，也能得到組成型突變株。 在平板上識別組成型突變株的方法，主要是利用在無誘導(dǎo)物存在時進行培養(yǎng)，它能產(chǎn)生酶，加入適當(dāng)?shù)牡孜镞M行反應(yīng)顯示酶活加以識別。經(jīng)常使用酶解后可以有顏色變化的底物，便于迅速撿出組成型菌落。如甘油培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)大腸桿菌時，誘導(dǎo)型菌株不產(chǎn)酶，組成型菌株可產(chǎn)生半乳糖苷酶。菌落長出后噴布鄰硝基苯半乳糖苷，組成型菌株的菌落由于能水解它而呈現(xiàn)硝基苯的黃色，誘導(dǎo)型則無顏色變化。另如羧甲基纖維素被內(nèi)切纖維素酶水解后，由于暴露出更多的還原性末端而能被剛果紅所染色?？捎纱朔奖愕貦z出纖維素酶產(chǎn)生菌。 3，降低分解代謝產(chǎn)物濃度，減少阻遏的發(fā)生 高分子的多糖類、蛋白質(zhì)等的分解代謝產(chǎn)物(如能被迅速利用的單糖、氨基酸以及脂肪酸、磷酸鹽等)都會阻遏分解其聚合物的水解酶類的生成。因此用限量流加這類物質(zhì)或改用難以被水解的底物的方法，都可減少阻遏作用的發(fā)生，而獲得較高的酶產(chǎn)量。但是由于它并未改變產(chǎn)生菌的遺傳特性，只是暫時地改變了酶的合成速率，因此結(jié)果往往不穩(wěn)定。更有效的方法是篩選抗降解物阻遏的突變棟。 4，解除分解代謝阻遏——篩選抗分解代謝阻退突變株 從遺傳學(xué)角度來考慮，如調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，使產(chǎn)生的阻遏蛋白失活；不能與末端分解代謝產(chǎn)物結(jié)合，或操縱基因發(fā)生突變使阻遏蛋白不能與其結(jié)合，都能獲得抗分解代謝阻遏的突變株。前者為隱性突變，后者為顯性突變，都能由此導(dǎo)致酶的過量產(chǎn)生。 可以直接以末端代謝產(chǎn)物為底物來篩選抗阻遏突變株，如以葡萄糖、甘油為碳源篩選纖維系酶抗阻遏突變株。但更多地是利用選育結(jié)構(gòu)類似物抗性菌株的方法。 它所依據(jù)的機制是，結(jié)構(gòu)類似物由于在分子結(jié)構(gòu)上與分解代謝的未端產(chǎn)物相類似，因此、它也能與阻遏蛋白相結(jié)合，如調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變而使阻遏蛋白不能與結(jié)構(gòu)類似物結(jié)合，即出現(xiàn)抗性菌株。由于分子結(jié)構(gòu)上的類似，這種抗性菌株產(chǎn)生的阻遏蛋白也不能與正常的分解代謝產(chǎn)物相結(jié)合，即同時也具有對相應(yīng)的分解代謝產(chǎn)物阻遏作用的抗性，而能導(dǎo)致相應(yīng)酶類的過量生產(chǎn)。 由于結(jié)構(gòu)類似物與正常代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)上的差異，它與阻遏蛋白的結(jié)合往往是不可逆的。氨基酸類的結(jié)構(gòu)類似物也不能用以合成具有正常功能的蛋白質(zhì)，因此它在細胞中會達到較高的濃度。這都是用結(jié)構(gòu)類似物為底物篩選抗阻遏菌株，較之用正常的分解代謝末端產(chǎn)物更為有效的原因。 如果結(jié)構(gòu)類似物與調(diào)節(jié)酶相結(jié)合，所獲得的便是抗反饋抑制的抗性菌株。篩選抗阻遏和抗反饋的雙重突變則更易于獲得高產(chǎn)菌株。對一末端產(chǎn)物的生成途徑了解的愈加清楚，就能定向選育多重突變株，而得到過量生產(chǎn)。 菌種選育中常用的結(jié)構(gòu)類似物列于表4—1。表中的類似物未區(qū)分其在作用機制上是抗阻遏或抗反饋，這是由于有的作用機制尚未完全弄清楚，有的則因菌種而異。 有些酶的合成可為銨鹽、磷酸鹽類所阻遏，用篩選對這類化合物的結(jié)構(gòu)類似物有抗性的突變株的方法，也可達到脫阻遏的效果。如構(gòu)巢曲霉的蛋白酶的合成可為銨鹽所阻遏，篩選抗甲基銨鹽的抗性突變株，其蛋白酶合成即不為銨鹽所阻遏。表41 結(jié)構(gòu)類似物及代謝末端產(chǎn)物 5，解除反饋抑制——篩選抗反饋抑制突變株 如上所述，在生物合成途徑中廣泛存在著反饋抑制調(diào)節(jié)——末端產(chǎn)物抑制合成途徑(包括分枝途徑)中第一個酶的活力，因此，降低末端產(chǎn)物的濃度就能積累代謝途徑中間體，如同由培養(yǎng)物中去除阻遏物一樣，這種方法的實施比較困難，比較有效的方法是選育對末端產(chǎn)物有抗性的突變株。如天冬氨酸激酶是賴氨酸生物合成途徑中的調(diào)節(jié)酶，由黃色短桿菌分離到對賴氨酸的類似物(2—氨基半胱氨酸)有抗性的突變株，它對天冬氨酸激酶的反饋抑制不敏感，賴氨酸的產(chǎn)量可達57mg/m1。 解除反饋抑制的另一種方法是選育營養(yǎng)缺陷型。即篩選喪失了合成途徑中某種酶，而必需供給某一中間代謝產(chǎn)物才能生長的突變株。限量供給此中間代謝產(chǎn)物就能降低或解除末端產(chǎn)物的反饋抑制，而獲得另—中間產(chǎn)物的過量產(chǎn)生。這在較簡單的直線式合成途徑中已獲得不少成功的實例。 谷氨酸經(jīng)過乙酰谷氨酸、烏氨酸、瓜氮酸而合成精氨酸(圖4—7)。經(jīng)誘變處理后得到的瓜氨酸營養(yǎng)缺陷型失去了合成催化鳥氨酸合成瓜氨酸的鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的能力，必需供給瓜氨酸或精氨酸時，此菌株才能生長。控制供給亞適量的精氨酸或瓜氨酸使菌體生長，但又不致引起反饋抑制時(精氨酸抑制N一乙酰谷氨酸激酶活力)，就能使鳥氨酸大量產(chǎn)生。如選育喪失精氨酸琥珀酸合成酶的精氨酸缺陷型，就能得到瓜氨酸的過量生產(chǎn)。 上述的直線式合成途徑中，用營養(yǎng)缺陷型方法只能使中間代謝產(chǎn)物積累而不能使末端產(chǎn)物積累。在分枝途徑中則能得到使末端產(chǎn)物過量產(chǎn)生的營養(yǎng)缺陷型突變。谷氨酸棒狀桿菌的蘇氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和賴氨酸的合成是與分枝途徑相聯(lián)系的(圖48)，篩選高絲氨酸營養(yǎng)缺陷型后，限量供給蘇氨酸時，就能解除由蘇氨酸和賴氨酸的協(xié)同反饋抑制作用，而獲得賴氨酸的過量生產(chǎn)。這是因為僅有賴氨酸或蘇氨酸存在時，天冬氨酸激酶不被抑制，只有兩者的協(xié)同效應(yīng)才能造成抑制。在限量供給蘇氨酸的情況下，即使賴氨酸過剩，抑制作用也很難發(fā)生。 6，防止回復(fù)突變的產(chǎn)生和篩選負變菌株的回復(fù)突變株經(jīng)誘變產(chǎn)生的高產(chǎn)菌株。在生產(chǎn)過程中易于發(fā)生回復(fù)突變，使生產(chǎn)不穩(wěn)定。雙重營養(yǎng)缺陷型發(fā)生回復(fù)突變的機率較小，易于獲得遺傳性較穩(wěn)定的菌株；如篩選得到的是抗結(jié)構(gòu)類似物的高產(chǎn)菌株，可在培養(yǎng)液中加入適量結(jié)構(gòu)類似物，以防止回復(fù)突變株的增殖。利用高產(chǎn)株和回復(fù)突變株對抗生素敏感性的不同，加適量抗生素防止回復(fù)株增殖，也是一類方法。 負變菌株的回復(fù)突變株亦可用來提高代謝產(chǎn)物的過量產(chǎn)生。 在無阻遏物或末端代謝產(chǎn)物存在條件下選育不產(chǎn)酶的負變株，繼續(xù)進行誘變后轉(zhuǎn)接在阻遏物或末端產(chǎn)物存在的條件下篩選產(chǎn)酶突變株，有可能獲得高產(chǎn)菌株。對其機制尚缺少深入研究。有的研究結(jié)果表明，抗阻遏突變株是啟動基因突變的結(jié)果，抗反饋突變株是調(diào)節(jié)酶的變構(gòu)中心發(fā)生了改變而催化中心未改變。 7，改變細胞膜的通透性 微生物細胞吸收作為代謝所需要的底物和離子是依靠定位在細胞膜上的主動物送系統(tǒng)來進行，與產(chǎn)能代謝過程相偶聯(lián)。輸送系統(tǒng)有高度的專一性，這主要取決于其蛋白質(zhì)的組成，即透性酶。透性酶的合成與由其輸送的酶類一樣，也受著調(diào)節(jié)控制。細胞內(nèi)形成的代謝產(chǎn)物排出細胞時，也與細胞膜的結(jié)構(gòu)有關(guān)，有各種類型的排出方式。細胞質(zhì)膜和細胞壁的結(jié)構(gòu)也影響物質(zhì)的進出。當(dāng)控制物理、化學(xué)條件或者篩選細胞膜、細胞壁結(jié)構(gòu)組成的突變株以改進物質(zhì)的進出速率。影響代謝過程時，都有可能造成代謝產(chǎn)物的過量生產(chǎn)。微生物細胞分泌到細胞外的蛋白質(zhì)特別是水解酶類，大多數(shù)是糖蛋白。酶分子中結(jié)合糖類與酶的催化活力無關(guān)，估計主要是利于分泌至胞外。同一類酶系中的不合糖類的酶組分，往往是結(jié)合在細胞膜上而很少分泌至胞外。加入表面活性劑，則有可能因改變細胞膜的通透性而獲得水解酶類的高產(chǎn)。由于表面活性劑種類繁多，性質(zhì)各異，尚未有規(guī)律可循。如加入吐溫80可增加里氏木霉纖維素酶產(chǎn)量，但對其它菌株就末得到同樣效果。 8，篩選抗生素抗性突變株 抗生素種類繁多，其抑制微生物代謝的機制各不相同，一些主要抗生素的作用機制已比較清楚。篩選抗生素抗性突變體，也能取得由此而改變代謝調(diào)節(jié)，獲得過量生產(chǎn)的結(jié)果。 衣霉素可抑制細胞膜糖蛋白的生成?？莶輻U菌的衣霉素抗性突變株的α—淀粉酶的產(chǎn)量較親株提高了5倍，研究結(jié)果表明，是由于分泌機制改變的結(jié)果?？估Ｆ降南灎钛勘U菌的無芽孢突變株的β—淀粉酶產(chǎn)量提高了7倍，這是由于芽孢形成的延遲利于β—淀粉酶的形成，而抗利福平的突變株往往失去了形成芽抱的能力。谷氨酸捧桿菌的抗青霉素突變株的谷氨酸產(chǎn)量亦會增加。 對金屬離子的抗性和對有絲分裂的抑制劑抗性的突變株，也被用于改變細胞代謝調(diào)節(jié)以得到代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)。 9，選育條件抗性突變株 因環(huán)境不同，能表現(xiàn)為“野生型”菌株的特性和突變型菌株特性的突變被稱為條件抗性突變或稱為條件致死突變。其中溫度敏感型突變常被用于提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。 適于在中溫條件下(如37。C左右)生長的細菌，經(jīng)誘變后可得到在較低溫度下生長而在較高溫度(如37。C以上)不能生長的突變株，即溫度敏感型突變株。這是由于某一酶蛋白結(jié)構(gòu)改變后，在高溫條件下活力喪失的緣故。如此酶為蛋白質(zhì)、核苷合成途徑上的酶，則此突變株在高溫條件下的表型就是營養(yǎng)缺陷型。誘變處理乳糖發(fā)酵短桿菌，得到的溫度敏感突變株，在30。C生長良好，在32‘C生長微弱，但能在富含生物素的培養(yǎng)基中積累谷氨酸，而野生型菌株卻受生物素的反饋抑制。在富含生物素的天然培養(yǎng)基中進行發(fā)酵時，可先在正常溫度下進行培養(yǎng)以得到大量菌體，適當(dāng)時間后提高溫度，就能獲得谷氨酸的過量生產(chǎn)。經(jīng)多次誘變后得到的高產(chǎn)菌株，往往是孢子形成能力減弱或喪失，這給保種傳代都帶來困難。篩選在低溫下能形成芽孢的溫度敏感突變株，就能解決此困難。 10，調(diào)節(jié)生長速率在酶的誘導(dǎo)合成研究中發(fā)現(xiàn)，一些物質(zhì)具有誘導(dǎo)效應(yīng)及難被利用；與其只能維持較低的生長速率有關(guān)。而起阻遏作用的物質(zhì)則部是易被迅速利用和能維持高的生長速率。估計這是因為誘導(dǎo)、阻遏的發(fā)生都與產(chǎn)能代謝有關(guān)而造成的。因此，改變培養(yǎng)條件如溫度、供氧量等以控制生長速率，也能獲得一定效果。 里氏木霉纖維素酶的大量合成是在菌體大量形成時，如控制它的比生長速率近于零，則能在一較長時間內(nèi)持續(xù)合成纖維素酶并獲得高產(chǎn)。 11， 加入酶的競爭性抑制劑 生物化學(xué)上把底物和抑制劑與酶相結(jié)合時呈現(xiàn)的互相排斥現(xiàn)象稱為競爭性抑制，即酶與抑制劑結(jié)合后就不能與底物相結(jié)合，反之亦然。葡萄糖經(jīng)不完全氧化(酵解)生成丙酮酸，脫羧生成乙酰輔酶A，進入三羧酸循環(huán)。乙酰輔酶A與草酰乙酸經(jīng)檸檬酸合成酶催化，把乙?；梢阴］o酶A轉(zhuǎn)移至草酰乙酸而成為檸檬酸。檸檬酸又因烏頭酸酶的存在而和它的異構(gòu)體順烏頭酸、異檸檬酸呈平衡。單氟乙酸在微生物細胞內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)閱畏鷻幟仕?，此酸與烏頭酸酶有競爭性抑制，因此，向培養(yǎng)基中加入單氟乙酸可導(dǎo)致檸檬酸的積累，減少異檸檬酸的生成。由此，篩選不能利用檸檬酸或?qū)畏宜崦舾械耐蛔円m，都達到了提高檸檬酸產(chǎn)量和減少異檸檬酸生成的結(jié)果。這些突變株的烏頭酸酶的活力都比較低。二、提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法次級代謝產(chǎn)物是指細胞生長不必需的、無明顯生理功能的微生物代謝產(chǎn)物。其結(jié)構(gòu)往往比較復(fù)雜，雖對產(chǎn)生菌的生長不是必需的，但在自然環(huán)境中對產(chǎn)生菌的存活還是有益的。從分子結(jié)構(gòu)上看，次級代謝產(chǎn)物可分為糖苷類、多肽類、?；?、核苷類及混雜類。它們均來自初級代謝產(chǎn)物，為其直接衍生物，或者經(jīng)分子結(jié)構(gòu)上的修飾，或進一步裝配、聚合而成。其合成過程遠較初級代謝產(chǎn)物復(fù)雜。初級代謝產(chǎn)物的形成一般只需簡單的營養(yǎng)條件，在化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中即可生成。而次級代謝產(chǎn)物則需要復(fù)雜的營養(yǎng)條件，往往需要供給營養(yǎng)成分復(fù)雜的天然物質(zhì)時才能形成。在各種條件下，初級代謝產(chǎn)物都能形成，而次級產(chǎn)物則往往僅在一特定培養(yǎng)條件下才能形成，尤其過量生產(chǎn)。在分批培養(yǎng)條件下，次級代謝產(chǎn)物一般都是在菌體生長的峰值出現(xiàn)后才大量合成。在發(fā)酵過程中如何使次級代謝產(chǎn)物進入分化期，即次級代謝產(chǎn)物形成的誘導(dǎo)或引發(fā)，是發(fā)酵工藝研究中的熱門之一。生理學(xué)上的研究表明，在菌體生長峰值過后，培養(yǎng)基中可利用的C、N、P、S等主要元素已基本耗完，與這些原料的利用有關(guān)的酶活力趨于下降，與次級代謝產(chǎn)物形成有關(guān)的酶類逐漸出現(xiàn)。但是，菌體生長與產(chǎn)物合成兩個時期的劃分及相應(yīng)的這些生理特性的變化還取決于培養(yǎng)條件?！壳埃渭壌x產(chǎn)物的生產(chǎn)都還是沿用分批發(fā)酵方法，抗生素類的產(chǎn)物在此條件下又多為在菌體生長速率下降后才積累，但又難以長期持續(xù)合成。因此，通過控制培養(yǎng)條件以盡量